响应面法优化红缘拟层孔菌胞外多糖发酵培养基

圣志存，郝利民，2，*，贾士儒，陶如玉，张 虹，鲁吉珂

（1.天津科技大学，工业发酵微生物重点实验室，天津300457；2.总后勤部军需装备研究所，北京100010；3.武装警察部队总部机关门诊部，北京100089；4.郑州大学生命科学学院，河南郑州450001）

响应面法优化红缘拟层孔菌胞外多糖发酵培养基

圣志存1，郝利民1，2，*，贾士儒1，陶如玉1，张 虹3，鲁吉珂2，4

（1.天津科技大学，工业发酵微生物重点实验室，天津300457；2.总后勤部军需装备研究所，北京100010；3.武装警察部队总部机关门诊部，北京100089；4.郑州大学生命科学学院，河南郑州450001）

为提高红缘拟层孔菌（Fomitopsis pinicola）胞外多糖（EPS）产量，采用响应面法对其发酵培养基进行优化。在单因素实验基础上，利用中心组合设计原理，以蔗糖、酵母粉、MgSO4·7H2O浓度为实验因素，以多糖产量为响应值，采用3因素5水平响应面分析方法建立数学模型。结果显示，红缘拟层孔菌产EPS的最佳培养基为：蔗糖186g/L、酵母粉7g/L，MgSO4·7H2O 27g/L，KH2PO42g/L。在此条件下，EPS产量预测值为4.02g/L，验证值为（3.92±0.18）g/L。采用响应面法对红缘拟层孔菌EPS发酵培养基进行优化，方法可行。

红缘拟层孔菌，红缘拟层孔菌胞外多糖，响应面

红缘拟层孔菌又名红缘层孔菌、红缘树舌、红带菌等[1]，为世界广泛分布的木腐真菌，生长在多种针叶树、阔叶树立木、倒木及腐朽木上，在我国东北地区常作为药用补肺益肾，镇痛解毒等。现代药理研究表明，该菌提取物具有抗菌、调节神经系统、增强免疫力、保护肝损伤、抑制肿瘤细胞和清除自由基等作用[2-5]。当前药用真菌活性物质几乎都来源于子实体，其生长状况及产量完全受自然条件的控制，野生菌难以满足人们的需求。红缘拟层孔菌液体培养有望解决子实体生长周期长和自然资源稀少的问题，值得进一步深入研究。目前，对红缘拟层孔菌的研究主要集中在菌丝体培养、胞内多糖及其活性研究等方面[6]，而对以胞外多糖为目标产物的红缘拟层孔菌发酵培养基的研究尚未见报道。

培养基成分是影响红缘拟层孔菌胞外多糖（EPS）产量的主要因素，对培养基进行优化是提高EPS产量的有效途径。响应面分析法通过合理设计实验，建立二次回归模型，对各因子水平及其交互作用进行优化与评价，寻求最优响应因子水平及响应值，可快速有效地确定多因子系统的最佳条件[7-11]。本文通过单因素和响应面分析实验优化胞外多糖产量适宜的培养基，可为后续红缘拟层孔菌EPS的药用开发奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

菌种 红缘拟层孔菌（Fomitopsis pinicola）菌种由总后勤部军需装备研究所提供；种子培养（g/L） 葡萄糖30，酵母粉5，KH2PO42，MgSO4·7H2O 10，pH6.0；酵母粉 天津市百世化工有限公司；蛋白胨 天津市化学试剂一厂；麦芽糖 海蓝季科技发展有限公司；乳糖 天津市德恩化学试剂有限公司；蔗糖、NaNO3、KH2PO4、MgSO4·7H2O、CaCl2、FeSO4、（NH4）2SO4、NH4Cl天津市北方天医化学试剂厂；以上试剂等级均为分析纯。

RE-300型旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂；SHZ-D（Ⅲ）型循环水式真空泵 巩义市予华仪器有限责任公司；QL-902型漩涡振荡器 海门市其林仪器制造有限公司；722s型可见分光光度计 上海精密科学仪器有限责任公司；UV-3600型紫外-可见分光光度计 日本岛津有限公司。

1.2 培养方法

1.2.1 液体菌种制备 取3～4块约0.5～1.0cm2的菌种块接种到盛有150mL液体种子培养基的500mL三角瓶中，28℃，180r/min振荡培养48h，得液体菌种。

1.2.2 液体培养 500mL三角瓶中分装135mL发酵培养基，10%接种量接种，28℃，180r/min振荡培养5d，得液体发酵液。

1.2.3 EPS提取及测定 取发酵液5mL加入3倍体积95%乙醇，4℃静置过夜。10000r/min，离心10min，收集沉淀。用65℃温水溶解，定容，苯酚硫酸法测EPS含量[12]。

1.3 实验设计

首先利用单因素实验筛选对红缘拟层孔菌EPS产量影响显著的因素，再利用部分因子实验和最陡爬坡实验确定对EPS产量较为显著的变量和其最佳浓度中心点，最后利用中心组合设计实验对红缘拟层孔菌EPS发酵培养基进行预测和验证。

1.3.1 单因素实验

1.3.1.1 碳源实验 分别以3%（w/v）的葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖为碳源，酵母粉0.5%，MgSO4·7H2O 1.0%，KH2PO42g/L培养红缘拟层孔菌5d，考察碳源对EPS产量的影响。

1.3.1.2 氮源实验 分别以0.5%的酵母粉、蛋白胨、NaNO3、NH4Cl、（NH4）2SO4为氮源，蔗糖5%，MgSO4·7H2O 1.0%，KH2PO42g/L培养红缘拟层孔菌5d，考察碳源对EPS产量的影响。

1.3.1.3 无机盐实验 分别以5%的蔗糖，1%的酵母粉为基础培养基，KH2PO4、MgSO4·7H2O、CaCl2、FeSO4的添加量筛选对EPS产量的影响较大的无机盐，再对其浓度进行优化。

1.3.2 部分因子设计实验 分别选取以上4个因素的高低2个水平，通过Design Expert软件的部分因子设计，以EPS产量作为响应值。通过比较各因素的显著性水平，筛选出对EPS产量影响较为显著的因素。表1为部分因子实验设计水平及其编码值。

表1 部分因子实验设计及其编码水平Table.1 The experiment design and coded level of fraction factor design

1.3.3 最陡爬坡实验 最陡爬坡实验以部分因子实验的中心点为路起始点向外延伸，由回归方程确定正负效应来增加或降低变量浓度。根据部分因子实验及其分析结果设计爬坡实验，即对显著因素进行浓度的梯度设计，不显著的因素取单因素EPS最佳浓度值。

1.3.4 中心组合设计实验 用中心组合设计进行响应面优化，通过实验数据拟合响应面模型，得到二次多项式，并最终确定最佳发酵条件。二次多项式为描述响应量（应变量）和自变量关系的经验模型[7]。中心组合水平取值见表2。

表2 中心组合设计水平及其编码Table.2 Range and levels of central composite design

1.4 统计分析

所有实验做3个平行，Excel进行实验数据误差分析。Design Expert软件对部分因子实验，中心组合设计实验进行数据分析。

2 结果与分析

2.1 单因素实验

2.1.1 碳源实验 由图1可知，红缘拟层孔菌产EPS最适碳源为蔗糖，蔗糖利用率较高可能是由于红缘拟层孔菌具有较高的蔗糖酶活性。有文献报道有些真菌以蔗糖为底物时，能分泌蔗糖酶催化底物蔗糖水解消耗[13]；另外，随着蔗糖浓度的上升，其EPS产量先上升后下降，在蔗糖浓度为15%时，EPS达到最大值。这可能是由于过低的底物浓度不能最大限度地满足红缘拟层孔菌的生长需求。相反，底物浓度过高导致培养基黏度增加，进而影响菌体的生长和产物的分泌。

2.1.2 氮源实验 由图2可知，红缘拟层孔菌产EPS最适氮源为酵母粉，这可能是由于酵母粉是有机氮源，其含有丰富的蛋白质、氨基酸和维生素，能够促进多糖的合成[14]。酵母粉浓度在1%时，EPS产量达到最大值，为1.57g/L。继续增加酵母粉浓度会抑制EPS的合成，这可能是由于酵母粉成分复杂，后期底物消耗不完，会诱导产生一些酶降解红缘拟层孔菌菌丝体。

图1 不同碳源及最佳碳源浓度对红缘拟层孔菌EPS的影响Fig.1 Effect of different carbon source and sucrose concentration on the EPS production of Fomitopsis pinicola

图2 不同氮源及最佳氮源对红缘拟层孔菌产EPS的影响Fig.2 Effect of different nitrogen source and yeast extract concentration on the EPS production of Fomitopsis pinicola

2.1.3 无机离子实验 由表3可知，对于相同添加量的无机盐，MgSO4·7H2O、KH2PO4对EPS产量影响较大。对两者浓度进行优化，如图3所示，其最适浓度分别为分别20g/L、2g/L。这可能是由于KH2PO4中的磷元素是合成菌体细胞膜磷脂双分子层的主要成分，磷含量适度过低（0.2%）会阻碍磷脂的合成，导致细胞膜通透性增加从而有利于EPS的分泌，过高会抑制EPS的释放；相反磷含量过低可能不能满足其正常生长需求。镁离子影响EPS产量的原因在于镁离子是各种酶的激活剂。同酵母粉类似，MgSO4·7H2O浓度过高，后期营养过剩，可能会激活降解红缘拟层孔菌菌丝体的酶类，反而不利于EPS的积累产生。

表3 不同无机盐对红缘拟层孔菌EPS产量的影响Table.3 Effect of different inorganic salts on the EPS production of Fomitopsis pinicola

2.2 部分因子设计实验及其结果

根据单因素实验结果，蔗糖、酵母粉、MgSO4·7H2O、KH2PO4是影响EPS产量的重要因素。首先，通过部分因子实验从四个因素筛选影响EPS产量的显著因子，表4为部分因子设计及其对应EPS产量值。由表5实验回归模型分析可以看出，影响EPS产量显著因子为蔗糖（p＜0.05）、酵母粉（p＜0.1），MgSO4·7H2O（p＜0.05），3个因素影响大小顺序为蔗糖＞MgSO4·7H2O＞酵母粉。运用Design Expert软件，得出EPS产量的多元一次回归模型为：Y=2.78+0.57X1-0.17X2-0.12X3+0.24X4。

2.3 最陡爬坡实验

响应面拟合方程只在考察的紧接邻域里才充分近似真实情形，在其他区域拟合方程与被近似的函数方程毫无相似之处，几乎无意义[15]。根据部分因子实验回归方程确定正负效应来增加蔗糖和MgSO4·7H2O浓度，同时降低酵母粉浓度，同时将KH2PO4的浓度固定为2g/L。由表6可知，从起点开始，EPS产量逐渐增加直至第4组，此后EPS产量逐渐降低。因此，将第4组的培养基组合（蔗糖180g/L，酵母粉7g/L，MgSO4·7H2O 26g/L，KH2PO42g/L）作为下面中心组合实验的中心点。

表4 部分因子设计结果Table.4 The result of fraction factor design

表5 部分因子设计多元回归模型系数评估及其显著性检验Table.5 Regression coeffecients estimation and their significance test for the quadratic polynomial model of fraction factor design

表6 最陡爬坡实验设计及其结果Table.6 Experiment design and results of thesteepest ascent path

表7 中心组合实验结果Table.7 The result of central composite design

表8 中心组合设计多元回归模型系数评估及其显著性Table.8 Regression coeffecients estimation and their significance test for the quadratic polynomial model of central composite design

2.3 中心组合设计实验及其结果

结合部分因子设计和最陡爬坡实验结果，进一步使用中心组合对影响EPS产量显著因子（蔗糖、酵母粉、MgSO4·7H2O）浓度进行3因素5水平响应面优化。各因素编码、水平及结果见表7。由表8、表9方差分析可知，以EPS产量为目标函数的回归方程的回归效果显著（p＜0.0001），回归方程为Y=4.02+0.12X1-0.046X2+0.040X4+0.015X1X2+5E-03X1X4+5E-03X2X4-回归模型方差分析结果见表9，模型p＜0.0001，说明模型在α=0.01水平上极显著。该模型的复相关系数R2=0.9520，失拟项不显著p=0.1373＞0.05，说明该模型相关性良好。校正决定系数R2=0.9088，说明90.88%的符合度，有很高的可信度。一次项显著性X1＞X2＞X4；二次项中X12、X22、X42显著性水平为极显著，交互项都不显著。

表9 中心组合设计的多元回归模型方差分析Table.9 Analysis of variance for the quadratic polynomialmodel of central composite design

2.5 响应面分析结果

由回归方程所作的响应面立体分析图如图4所示，响应面值存在最大值。固定其中两因素时，酵母粉对响应值EPS产量呈抛物线关系，蔗糖、MgSO4·7H2O趋势则呈不同程度上升后变为平缓。RSM三维图坡度表示响应值受各变量因素的影响大小。由图4可知，蔗糖和酵母粉，MgSO4·7H2O和酵母粉三维图坡度较蔗糖和MgSO4·7H2O陡峭，其结果说明另两者因素取值固定时，单因素蔗糖、酵母粉对EPS产量的影响大于MgSO4·7H2O；响应值与3个实验因素并非线性关系，只有特定条件下，EPS产量才能达到最大值。利用Design Expert软件，进行分析计算，得到合成EPS的最佳培养基为：蔗糖浓度为186.24g/L、酵母粉浓度为6.91g/L、MgSO4·7H2O 26.71g/L。考虑实际操作，确定最佳培养基成分分别为蔗糖浓度为186g/L、酵母粉浓度为7g/L、MgSO4·7H2O 27g/L，此条件下EPS产量预测值为4.02g/L。为了检测模型方程的适用性，在响应面最佳培养条件下进行三组平行重复验证，测得EPS产量平均值为（3.92±0.18）g/L，基本和预测值相近，说明多元二次回归模型可以准确预测EPS产量。

图4 实验因素两两交互作用响应曲面图Fig.4 Response surface polts showing the effects between two experimental factors

3 结论

在单因素实验基础上，利用部分因子设计、中心组合设计实验对红缘拟层孔菌产EPS的发酵条件进行了响应面优化，建立了EPS与显著因子蔗糖、酵母粉、MgSO4·7H2O 3个因素的二次多项式回归模型，经验证实验证明该模型合理可靠。最终确定红缘拟层孔菌产EPS的最佳培养基为：蔗糖186g/L、酵母粉7g/L，MgSO4·7H2O 27g/L，KH2PO42g/L。在此条件下，EPS产量高达4.02g/L，重复验证测得EPS产量平均值为（3.92±0.18）g/L，两者相对偏差小于5%。因此，采用响应面法优化红缘拟层孔菌培养基组成稳定可行，可为后续红缘拟层孔菌的液体规模培养及多糖产物的放大制备奠定基础。

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Optimization of culture medium of Fomitopsis pinicola for exopolysaccharide production by response surface methodology

SHENG Zhi-cun1，HAO Li-min1，2，*，JIA Shi-ru1，TAO Ru-yu1，ZHANG Hong3，LU Ji-ke2，4
（1.Key Laboratory of Industrial Fermentation Microbiology，Tianjin University of Science and Technology，Tianjin 300457，China；2.The Quartermaster Equipment Institute of General Logistics Department of People’s Liberation Army，Beijing 100010，China；3.The Outpatient Department of Armed Police Forces of General Headquarters，Beijing 100089，China；4.School of Life Sciences，Zhengzhou University，Zhengzhou 450001，China）

Response surface methodology was employed to optimize the culture medium for exopolysaccharide production from Fomitopsis pinicola.Exopolysaccharide yield was investigated with respect to the concentration of sucrose，yeast extract and MgSO4·7H2O based on these results of single factor experiment.A quadratic regression model was established on a three-variable，five-level center composite design.The optimum concentration of sucrose，yeast extract and MgSO4·7H2O were 186g/L，7g/L and 27g/L，resepectively.Under these conditions，the predicted value of EPS yield was 4.02g/L，while the actual value was（3.92±0.18）g/L.So response surface methodology was feasible for optimization of fermentation medium of Fomitopsis pinicola for EPS production.

Fomitopsis pinicola；Fomitopsis pinicola exopolysaccharide；response surface methodology

TS201.3

A

1002-0306（2014）02-0194-06

2013－12－09 *通讯联系人

圣志存（1988-），男，硕士研究生，研究方向：发酵工程原理。