一株酸性淀粉酶产生菌的分离鉴定及其酶学性质研究

刘 洋，王一琰，白黎婧，相宏宇，朱洪亮，谢秋宏，*

（1.吉林大学生命科学学院，吉林长春130012；2.淄博国澳生物酶技术有限公司，山东淄博255000）

一株酸性淀粉酶产生菌的分离鉴定及其酶学性质研究

刘 洋1，王一琰1，白黎婧1，相宏宇1，朱洪亮2，谢秋宏1，*

（1.吉林大学生命科学学院，吉林长春130012；2.淄博国澳生物酶技术有限公司，山东淄博255000）

用含有淀粉的选择培养基，通过透明圈法筛选到一株产酸性淀粉酶的菌株，其发酵液酶活力达到123U/mL。通过形态观察。生理生化实验和16S rDNA序列分析等方法初步鉴定该菌株为地衣芽孢杆菌，命名为Bacillus lincheniformis BW-2。对其产生的淀粉酶的酶学性质进行分析发现，该菌株产生的淀粉酶最适反应温度为70℃；最适反应pH为4.5，同时具有较好的热稳定性和pH稳定性；Ca2+和Mg2+对该酶有激活作用，Mn2+和Cu2+对该酶有抑制作用，抑制剂PMSF（苯甲基磺酰氟）及DTT（二硫苏糖醇）对该酶活力影响较小。通过PAGE分析发现BW-2产生的淀粉酶与已知热稳定淀粉酶分子量或结构可能存在差异。Bacillus lincheniformis BW-2是一株具有研究开发潜力的产酸性淀粉酶的菌株。

酸性淀粉酶，菌株筛选，分离鉴定，酶学性质

α-淀粉酶[EC3.2.1.1]属于糖苷水解酶类。它水解淀粉的α-1，4和α-1，6糖苷键，同时生产低分子量产物如葡萄糖、麦芽糖和麦芽糊精等。淀粉酶广泛分布于自然界。所有植物、动物和微生物几乎都含有淀粉酶。淀粉酶是研究较多、生产最早、应用最广和产量最大的一种酶，其产量占整个世界酶生产市场的30%以上[1-2]。淀粉酶在工业上被广泛用于燃料酒精、淀粉糖浆、传统酿造、食品加工和纺织退浆等行业[3-5]。

在淀粉加工过程中，淀粉酶首先在高温下液化淀粉，淀粉浆的自然pH通常为4.5左右[6]，而大多数的商品细菌α-淀粉酶最适作用pH约为6.5左右[7]，且在低pH条件下不稳定。因此，pH在淀粉液化前需调至5.8～6.2。然后再进行糖化酶糖化步骤。但糖化酶的最适作用pH通常在4.5左右，因此，液化淀粉pH又必须调至酸性。两步pH调节过程大大的增加了淀粉加工成本。虽然诺维信与杰能科两大酶制剂公司已相继推出最适pH为5.0的淀粉酶，但其在较低pH下酶活力明显降低[8-11]。近年来，国内外对酸性淀粉酶生产菌株做了大量研究。谢建华等[12]筛选到一株解淀粉芽孢杆菌，其产生的酸性淀粉酶最适pH为5.0，最适温度为40～45℃。钱萍[13]通过复合诱变黑曲霉，获得一株酶活力比原始菌株提高10倍的诱变株，同时该诱变株产生的酸性淀粉酶最适pH为4.0，且在50℃、pH4.0条件下酶活力稳定。Sajedi等[7]分离到一株酸性淀粉酶产生菌Bacillus sp.KR-8104，并对其产生的酸性淀粉酶进行了纯化和酶学性质分析。尽管目前对酸性淀粉酶的研究很多，但还没有一株酸性淀粉酶菌种达到工业要求[13]。因此，筛选获得产酸性淀粉酶生产菌株具有重要意义。

本研究从长白山温泉口土壤中筛选到一株酸性淀粉酶生产菌株，对其进行了形态观察、生理生化实验和16S rDNA序列分析，并进一步研究了其产酶的酶学性质，同时与现有热稳定淀粉酶进行了PAGE分析对比。该研究对酸性淀粉酶产生菌及其基因资源的开发提供了重要的材料基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

本研究样品 采自长白山温泉口土壤；热稳定淀粉酶X1 为本实验室保存；可溶性淀粉 分析纯，国药集团化学试剂有限公司；蛋白胨、酵母浸粉 分析纯，北京奥博星生物技术有限公司；氯化钠等 分析纯，北京化工厂；细菌基因组DNA提取试剂盒 北京百泰克生物技术有限公司；筛选培养基（g/L） 生玉米淀粉 300，NaNO32，KH2PO41，MgSO40.5，KCl 0.5，FeSO40.01，琼脂20，pH4.8；种子培养基（g/L）

酵母浸粉5，蛋白胨10，NaCl 10，pH5.0；发酵培养基（g/L） 酵母浸粉5，蛋白胨10，NaCl 10，可溶性淀粉10，pH5.0。

超净工作台SW-CJ-2FD 苏净集团安泰空气技术有限公司；电热恒温培养箱DNP-9162 上海精密科学仪器有限公司；双层小容量全温度恒温摇床ZHWY-2102C 上海智城分析仪器制造有限公司；电子分析天平FA2204B 上海精密科学仪器有限公司；灭菌器54DWS 厦门致微仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 菌株筛选方法 取2g土样，加入到装有50mL无菌水的250mL锥形瓶中，内有无菌玻璃珠若干，将土样振荡摇均后，用无菌水将其梯度稀释，取适宜梯度稀释液100μL，涂布于筛选培养基上，于37℃培养箱倒置培养48h；待菌落长出后，用碘熏蒸；将透明圈较大的菌株分别进行分离、纯化后，发酵制取粗酶液，通过酶活力测定进行复筛，将酶活力较高的菌株甘油保存，供进一步菌种鉴定及酶学性质分析用[14]。

1.2.2 粗酶液的制备 将菌株接种于种子培养基中，37℃，150r/min培养48h。以2%接种量接种于发酵培养基内，37℃，150r/min发酵72h。将培养液12000r/min，离心10min上清液即为发酵粗酶液。

1.2.3 淀粉酶活力的测定 淀粉酶活力测定：根据参考文献[15]采用小体系DNS法测定淀粉酶活力，以2%的可溶性淀粉为底物，加入100μL 50mmol/L pH6.0的磷酸缓冲液，60℃水浴锅内保温30min，迅速取出，放入冰浴内，并向反应体系中加入20μL，1mol/L NaOH终止反应。然后从反应体系中取出50μL反应液，加入到盛有100μL去离子水的EP管内，再加入200μL DNS溶液，沸水浴准确反应5min。从中取出20μL至96孔板内，再加入250μL水，混合均匀后，测量540nm处吸光度值。根据葡萄糖标准曲线计算酶反应释放的还原糖量，从而计算淀粉酶活力。淀粉酶活力定义为：在实验条件下，1h释放1mg的还原糖所需要的酶量为1个酶活力单位。

1.2.4 菌株的形态观察及生理生化实验 将复筛中酶活力较高的菌株进行甘油保存后，分别接种于固体筛选培养基及液体种子培养基内。37℃培养48h后，观察固体平板上的菌落形态及淀粉水解圈大小，从培养液中吸取少量菌液在显微镜下观察显微形态。菌株的生理生化实验参照文献[16]进行。

1.2.5 菌株的16S rDNA序列分析 采用细菌基因组DNA提取试剂盒提取菌株基因组DNA。采用通用引物27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和1401R（5′-GCGTGTGTACAAGACCC-3′）扩增细菌的16S rDNA[17]。扩增体系为20μL：2×rTaq 10μL，引物各0.8μL，模板0.4μL，补加ddH2O到20μL。扩增程序为：94℃4min；94℃40s，55℃50s，72℃100s，30个循环；72℃10min。PCR产物连接至TA载体后送上海生工生物工程技术服务有限公司测序。将测序结果在NCBI上进行BLAST同源比对分析，选取同源性较高的序列经ClustalX程序比对后，用MEGA 4.1软件采用邻接法构建系统发育树[18]。（GenBank accession number：KF311767）

1.2.6 温度对淀粉酶活力的影响 分别测定粗酶液在pH6.0，温度为40、50、60、70、80、90℃时的酶活力，反应时间为30min，以酶活力最高时的相对酶活力为100%，计算其他温度下的相对酶活力，以考察温度对酶活力的影响。

1.2.7 pH对淀粉酶活力的影响 分别测定粗酶液在70℃，pH为3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5时的酶活力，反应时间为30min，以酶活力最高时的相对酶活力为100%，计算其他pH下的相对酶活力，以考察pH对酶活力的影响。

1.2.8 淀粉酶热稳定性实验 取一定量酶液，分别在pH4.5，70、80、90℃水浴条件下保温处理，每隔一定时间取样一次，并迅速冷却，在最适条件下测定酶活力，以初始酶液为对照样品，测定不同时间下淀粉酶的残余活力。

1.2.9 淀粉酶pH稳定性实验 取一定量酶液，分别在pH为3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0条件下，70℃水浴保温30min后，在最适条件下测定酶活力，以酶活力最高时的残余活力为100%，计算不同pH下的残余酶活力。

1.2.10 金属离子及抑制剂对酶活力的影响 在酶反应体系中分别加入Ca2+、Na+、Zn2+、Mg2+、Mn2+、K+、Cu2+和Fe2+及PMSF和DTT，使其在酶反应体系的终浓度为5mmol/L，以不加金属离子及抑制剂的样品为对照，分别进行酶活力测定，以对照样品的酶活力为100%，计算在不同金属离子及抑制剂存在时的相对酶活力，以考察其对酶活力的影响。

1.2.11 PAGE分析淀粉酶 将BW-2发酵液，浓缩后，作PAGE分析。以菌株Bacillus lincheniformis产生的热稳定α-淀粉酶X1作为阳性对照。样品于80℃水浴中处理10min后上样进行PAGE分析。同时作两块PAGE，电泳结束后，一块胶进行考马斯亮蓝染色，另一块胶在含有2%可溶性淀粉的pH6.0磷酸缓冲液中浸泡振荡1h，然后于70℃中酶解1h后用稀碘液染色。

1.3 数据处理

采用Excel及Origin 7.5软件进行数据处理及作图。

2 结果与分析

2.1 菌株筛选

经过水解圈法初步筛选，从200个菌落中获得了菌落形态不同、水解圈较大的11个菌株，将它们分别分离、纯化发酵培养后，进行酶活力测定复筛。结果发现其中1株产淀粉酶活力最高，其粗酶液活力为123U/mL，高于已有文献报道[4，18]。我们将该菌株暂定命名为BW-2，并对其进行了形态学观察、生理生化实验和16S rDNA序列分析以及所产生的α-淀粉酶的酶学性质研究。

2.2 菌株的形态观察、生理生化实验及16S rDNA序列分析

形态及显微观察结果如图1所示，A为形态观察结果，B为显微观察结果，从实验结果可以看出，菌株在筛选培养基上表面干裂，呈白色，同时培养基上有明显的淀粉水解圈；从显微观察结果可以看出，该菌株有芽孢，且明显为短杆状。菌株的生理生化特征见表1。由形态观察及生理生化特征结果可以初步确定该菌株为芽孢杆菌属。

图1 菌株BW-2的形态观察Fig.1 Morphological observation of the stain BW-2注：A：固体培养基上形态观察；B：显微镜观察（16×40）。

表1 菌株BW-2的常规生理生化反应特征Table.1 Ttadition taxonomical properties of the strain BW-2

进一步对菌株进行16S rDNA序列分析，提取该菌株基因组DNA，用通用引物27F和1401R，以基因组DNA为模板，进行PCR扩增。扩增产物约为1400bp，经胶回收连接到TA载体上，转化至大肠杆菌中。提取质粒后，进行测序。所测得序列大小为1402bp，在NCBI上进行BLAST，该菌株与地衣芽孢杆菌一些种的序列同源性最高，达到99%以上，与相关菌株亲缘关系见图2。结合菌株的形态特征、生理生化实验及16S rDNA序列分析，最终确定该菌株为地衣芽孢杆菌，命名为Bacillus lincheniformis BW-2。

2.3 温度对酶活力的影响

图2 BW-2菌株16S rDNA系统发育进化树Fig.2 Phylogenetic trees for 16S rDNA sequence of BW-2

温度对酶活力的影响如图3所示，从图3中可以看出，该淀粉酶的最适反应温度为70℃，同时，该酶具有较宽的反应温度范围，在60～90℃时都能保持90%以上的相对酶活力。该实验结果与Arikan报道的由Bacillus sp.A3-15生产的热稳定性淀粉酶最适温度一致，同时两者都具有较宽反应温度范围[19]。

（4）对于虾蟹养殖户，政府暂无相应补贴与鼓励政策，养殖户通过购买商业保险降低自身风险。养殖户自产自销，基本无滞销现象。土地承包商雇佣当地的闲置劳动力，闲置劳动力年龄一般为60周岁以上。

2.4 pH对酶活力的影响

图3 温度对酶活力影响Fig.3 Effect of temperature on activities of amylase

pH对酶活力的影响如图4所示，从图4中可以看出，该酶最适反应pH为4.5，在3.5～7.0范围内，其相对酶活力可以维持在90%以上。该结果说明，菌株Bacillus lincheniformis BW-2生产的淀粉酶为酸性淀粉酶[12]。Liu等[20]从一种新型芽孢杆菌YX-1中提取了一种α-淀粉酶，最适作用pH同样为4.5。但其最适作用温度为40～50℃，大于60℃时，其酶活力显著下降。因此Bacillus lincheniformis BW-2产生的淀粉酶与YX-1相比，在淀粉水解工艺中有更大的使用空间。

2.5 淀粉酶的热稳定性

淀粉酶的热稳定性的实验结果如图5所示，从结果中可以看出，菌株Bacillus lincheniformis BW-2产生的淀粉酶在70℃保温120min，其残余酶活力仍能维持100%，在80℃条件下保温120min，其残余酶活力可以维持在82%，说明该酶在酸性条件下有良好的热稳定性。

2.6 淀粉酶的pH稳定性

图4pH对酶活力影响Fig.4 Effect of pH on activities of amylase

图5 酶的热稳定性Fig.5 Thermal stability of the amylase

图6 酶的pH稳定性Fig.6 pH stability of the amylase

2.7 金属离子及抑制剂对酶活力影响

金属离子及抑制剂对酶活力的影响如图7所示。从图7中可以看出，与对照相比Ca2+和Mg2+对菌株Bacillus lincheniformis BW-2所产生的淀粉酶有激活作用。推测其可能是钙依赖的淀粉水解酶类。Mn2+和Cu2+有抑制作用，而其他离子对淀粉酶没有影响。抑制剂PMSF及DTT对淀粉酶活力影响较小。PMSF为丝氨酸抑制剂，可能是由于丝氨酸不是该淀粉酶的活性中心。DTT可以还原蛋白质二硫键，可能是由于该蛋白质不存在二硫键或二硫键的破坏并不影响该淀粉酶活性中心的结构。

2.8 淀粉酶的PAGE分析

图7 金属离子和变性剂对酶活力的影响Fig.7 Effect of metal ions and inhibitor on enzymatic activity

对BW-2发酵液和X1按1.2.11的方法处理后，实验结果如图8所示，由图8可以看出，热稳定淀粉酶X1和BW-2发酵液在80℃水浴10min后均有较明显的淀粉酶水解条带，说明BW-2生产的淀粉酶与热稳定淀粉酶X1耐热性质相似，在80℃的条件下，保温10min仍有水解淀粉能力，同时，从两者亮带位置的差异来看，BW-2产生的淀粉酶与热稳定淀粉酶X1的分子量或结构可能存在差异，推测其是新的淀粉酶，这一结论需要进一步的实验验证。

图8 淀粉酶的PAGE分析Fig.8 PAGE analysis of the amylase

3 结论

本研究使用含淀粉的选择培养基，从长白山温泉土壤中筛选到一株产酸性淀粉酶的产生菌株，其发酵液活力为123U/mL。通过形态观察、生理生化实验及16S rDNA序列分析初步确定其为地衣芽孢杆菌，命名为Bacillus lincheniformis BW-2。进一步对其酶学性质分析发现，该淀粉酶最适反应温度为70℃，最适反应pH为4.5；在pH4.5的条件下，70℃和80℃保温120min，其残余活力分别为100%和82%，说明其有较好的热稳定性，pH4.5～7.0，70℃保温30min，其残余活力均可维持在90%以上，说明其具有较好的pH稳定性。通过研究金属离子及抑制剂对酶活力影响发现，Ca2+和Mg2+对该淀粉酶有激活作用，Mn2+和Cu2+有抑制作用，抑制剂PMSF及DTT对该淀粉酶活力影响较小。通过PAGE分析发现BW-2产生的淀粉酶与已知热稳定淀粉酶分子量或结构可能存在差异。本研究为菌株下一步的培养基和培养条件优化，菌种改良及酸性淀粉酶的应用，提供了重要的实验基础和材料基础。

[1]Rana N，Walia A，Gaur A.α-Amylases from microbialsources and its potential applications in various industries[J].National Academy Science Letters，2013，36（1）：9-17.

[2]Maarel V D M，Bart V D V，Joost C M，et al.Properties and applications of starch converting enzymes of the a-amylase family[J].Journal of Biotechnology，2002，94：137-155.

[3]刘旭东，徐岩.一种新的中温酸性α-淀粉酶的分离纯化及酶学性质[J].应用与环境微生物学报，2008，14（2）：235-239.

[4]王晓燕，高润池，廖昌珑，等.Geobacillus sp.A27的分离筛选及其淀粉酶酶学性质研究[J].食品工业科技，2011，32（1）：151-155.

[5]Pandey A，Nigam P，Soccol C R，et al.Advences in microbial amylases[J].Biotechnology and Applied Biochemistry，31（Pt2），2000：135-152.

[6]Sivaramakrishnan S，Gangadharan D，Nampoothiri K M，et al. Alpha-amylases from microbial sources-an overview on recent developments[J].Food Technology and Biotechnology，2006，44（2）：173-184.

[7]Sajedi R H，Naderi-Manesh H，Khajeh K，et al.A Caindependent alpha-amylase that is active and stable at low pH from the Bacillus sp.KR-8104 [J].Enzyme and Microbial Technology，2005，36（5-6）：666-671.

[8]Goyal N，Gupta J K，Soni S K.A novel raw starch digesting thermostable α-amylase from Bacillus sp.I-3 and its use in the direct hydrolysis of raw potato starch[J].Enzyme and Microbial Technology，2005，37：723-734.

[9]Gupta R，Gigras P，Mohapatra H，et al.Microbial α-amylase：a biotechnologicalperspective [J].Process Biochemistry，2003，38：1599-1616.

[10]Crab W，Mitchinson C.Enzymes involved in the processing of starch to sugars[J].Trends Biotechnology，1997，15：349-352.

[11]Shoji H，Toshikazu S，Kenji H，et al. Simultaneous production of glucoamylase and acid-stable α-amylase using novel submerged culture of Aspergillus kawachii NBRC4308[J]. Jounal of Bioscience and Bioengineering，2007，103：203-205.

[12]谢建华，师永生，杜丽琴，等.一株产酸性α-淀粉酶菌株的筛选、纯化及酶学性质[J].应用与环境生物学报，2011，17（1）：95-99.

[13]钱萍.酸性淀粉酶菌株的诱变选育及酶学性质研究[J].食品工业科技，2011，33（11）：183-186.

[14]冯旭明，迟乃玉，张庆芳.低温淀粉酶菌株C2的分离鉴定及其产低温淀粉酶的酶学性质[J].微生物学通报，2011，38（12）：1762-1767.

[15]刘洋，唐芳荣，相宏宇，等.小体系高通量比色测定糖化酶活力新方法[J].中国酿造，2012，31（7）：140-143.

[16]Hot G J，Krieg R N，Sneath HAP，et al.Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology[M].9th ed.Baltimore：Williams and Wilkins，1994.

[17]张保国，唐玲李祖明，等.阿维菌素杀虫剂对甘蓝叶际微生物群落结构的影响[J].环境科学，2009，30（5）：1291-1297.

[18]秦臻，蔡素梅，黄钧，等.一株产生淀粉分解酶犁头霉的分离鉴定及其酶学性质[J].微生物学通报，2011，38（5）：729-735.

[19]Burhan Arikan.Highly thermostable，thermophilic，alkaline，SDS and chelator resistant amylase from a thermophilic Bacillus sp.isolate A3-15[J].Bioresource Technology，2008，99：3071-3076.

[20]Xu D L，Yan X.A novel raw starch digesting α-amylase from a newly isolated Bacillus sp.YX-1：Purification and characterization[J].Bioresource Technology，2008，99：4315-4320.

Study on isolation and identification of acidic α-amylase producing strain and enzymatic properties

LIU Yang1，WANG Yi-yan1，BAI Li-jing1，XIANG Hong-yu1，ZHU Hong-liang2，XIE Qiu-hong1，*
（1.School of Life Science，Jilin University，Changchun 130012，China；2.Zibo Guoao Biological Enzyme Technology Co.，Ltd.，Zibo 255000，China）

An acidic α-amylase producing strain was screened through screening medium supplemented with starch by the method of hydrolysis halo，and the amylase activity of the fermentation broth was 123U/mL.The stain was identified as Bacillus lincheniformis by morphology observation，physiological and biochemical tests and 16S rDNA sequence analysis，and was named as Bacillus lincheniformis BW-2.The enzymatic properties of the amylase were also investigated.The optimum pH and temperature of the amylase was 4.5 and 70℃，respectively.It also showed excellent thermostability and pH stability.The amylase activity was activated by Ca2+and Mg2+，whereas，it was inhibited by Mn2+and Cu2+.Meanwhile，these inhibitors PMSF and DTT had little effect on the enzyme activity.The molecular weight and structure of the amylase from BW-2 maybe was different from the known thermostable amylase by PAGE analysis.BW-2 was an acidic amylase producing strain which showed research and development potential.

acidic amylase；screening；isolation and identification；enzymatic properties

TS201.3

A

1002-0306（2014）04-0174-05

2013－07－16 *通讯联系人

刘洋（1983-），男，在读博士研究生，主要从事微生物酶方面的研究。

国家自然科学基金项目（81072564）；吉林省科技厅科技发展计划重点项目（20090945）。