马铃薯淀粉废水中高絮凝菌种的絮凝研究

马姝雯，王明明

（西北民族大学生命科学与工程学院，甘肃兰州730124）

马铃薯淀粉废水中高絮凝菌种的絮凝研究

马姝雯，王明明*

（西北民族大学生命科学与工程学院，甘肃兰州730124）

从马铃薯淀粉废水中筛选分离出高效絮凝菌种白地霉、青霉、红曲霉、酵母菌，以高岭土悬浊液为模拟絮凝对象，分别进行单菌种、复配菌种的絮凝实验，优化培养条件，测定其絮凝率、废水培养基COD值和BOD5值。结果表明：单菌种絮凝时白地霉的絮凝效果最好，其最优絮凝条件为35℃，pH5.0，培养5d，此时絮凝率高达92.39%；白地霉经培养后废水培养基COD去除率达到90.32%，BOD5去除率达到86.0%。通过对复配菌种的絮凝效果进行比较，得出白地霉与青霉复配的絮凝效果最好，絮凝率为92.47%，经培养后废水培养基COD去除率达到93.21%，BOD5去除率达到90.15%。

马铃薯淀粉废水，高絮凝菌种，絮凝率

马铃薯淀粉生产中产生的废水主要来自两个部分：一是清洗马铃薯产生的废水，这部分废水主要成分为马铃薯表面的泥沙，经沉淀处理后可循环使用。二是生产淀粉工艺过程产生的废水，这部分废水不能循环使用，废水中主要含有淀粉、蛋白质、糖、纤维等有机物，COD、BOD5浓度很高。这部分废水的处理国内目前主要有化学絮凝和生物处理两种方法，两种方法各有利弊。兰州大学王友乐等[1]从兰州大学校园花园里的土壤、兰州雁儿湾污水处理厂二沉池活性污泥霉变物和不同厂家生产的4种酱油中分离出菌种，再经马铃薯淀粉废水培养分离出了两株絮凝性较高的根霉，复配后实验表明对马铃薯淀粉废水有较好的絮凝效果。

在实际生产中马铃薯淀粉废水中的蛋白质具有自动凝聚的趋势，但这种凝聚方式形成的颗粒很小，絮凝很不稳定。根据这个特性我们从马铃薯淀粉废水自然沉淀物中筛选出来具有优良絮凝性能的三株霉菌和一株酵母菌，研究其絮凝特性，优化培养条件。

微生物絮凝剂是一类由微生物产生的有絮凝活性的代谢产物主要成分为糖蛋白、多糖、蛋白质、纤维素和DNA等[2]，具有良好的絮凝沉淀性能，安全、高效、无毒，可生物降解，且不产生二次污染，它的研究已成为絮凝剂领域的热点，在给排水处理等方面有广阔的应用前景。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

菌种 由兰州中盛瑞泽马铃薯淀粉有限公司马铃薯淀粉工艺废水沉淀物中分离；牛肉膏、蛋白胨、琼脂粉、高岭土、葡萄糖、尿素[CO（NH2）2]、氯化钠（NaCl）、氯化钙（CaCl2）、硫酸铵[（NH4）2SO4]、磷酸氢二钾（K2HPO4）、磷酸二氢钾（KH2PO4）、重铬酸钾（K2Cr2O7）、硫酸铬钾[CrK（SO4）2·12H2O]、硫酸亚铁（FeSO4·7H2O）、1，10-菲咯啉（C12H8N2·H2O）、硝酸银（AgNO3）、硫酸银（Ag2SO4）、浓硫酸（H2SO4）、浓磷酸（H3PO4）、硫酸亚铁铵[Fe（NH4）2（SO4）2·6H2O]、亚硫酸钠（Na2SO3）、硫酸汞（HgSO4） 以上药品均为分析纯。

洁净工作台 吴江市生化净化设备厂；DPH-9297型电热恒温培养箱 上海雷韵实验仪器制造有限公司；HZP-250型全温振荡培养箱 江苏太仓市实验设备厂；LDZX-75KBX型立式压力蒸汽灭菌器 上海龙捷仪器设备有限公司；光学显微镜 德国徕卡仪器有限公司；722E型可见光分光光度计 无锡市英之城高速分析仪器有限公司；TGL-16M型高速台式冷冻离心机 江苏省金坛市恒丰仪器制造有限公司；DHG-9241A型电热恒温干燥箱 上海精宏仪器有限公司；PB-10型台式酸度计 德国赛多利斯仪器有限公司；ZK型高速自控组织捣碎机 江苏省龙岗医疗器械厂；ME11型数码显微镜 德国徕卡仪器有限公司。

1.2 培养基

固体培养基：马铃薯葡萄糖培养基（PDA）；液体种子培养基：PDA液体培养基；废水培养基：稀释后的马铃薯淀粉工艺废水，121℃灭菌30min；以上培养基放在37℃温箱中培养24h。

1.3 实验方法

1.3.1 高絮凝菌种的分离和纯化 采用稀释倍数法对菌种进行分离，选取形态不同的有代表性的单个菌落镜检，初步确定为纯菌株后，再经多次平板划线分离纯化，直到得到的菌落特征一致为止。挑取培养的不同菌落的菌丝，接种到PDA液体培养基中，30℃150r/min摇床培养72h，再从中吸取20mL菌种发酵液进行絮凝实验，从而初步筛选出废水中高效絮凝菌株。

1.3.2 菌种的鉴定 用无菌水制成菌悬液，稀释，接种0.2mL至不同的生化鉴定培养基中进行鉴定实验，具体操作方法见参考文献。观察菌落外部形态特征，根据魏景超著《真菌鉴定手册》，确定高絮凝菌种类型。

1.3.3 单菌种絮凝实验

1.3.3.1 絮凝率的计算[3]以0.1%（W/W）的高岭土悬浊液为模拟实验对象，采用1%（W/W）的氯化钙溶液作为助凝剂，在98mL高岭土悬浊液中加入1%氯化钙溶液1mL，再加入1mL各菌种发酵液或其复配液，在300r/min条件下快速搅拌60s，然后在100r/min下慢速搅拌10min，静置10min后，从上层清液移取1mL测定其吸光度，同时以不加发酵液的高岭土悬液作空白对照实验。絮凝率计算公式如下：

絮凝率（%）=（A-B）/A×100

式中：A—空白实验在550nm处的吸光度，B—样液实验在550nm处的吸光度。

1.3.3.2 絮凝活性分布的确定 将10mL发酵液在15000r/min下，离心20min，取上清液。得到的菌体经蒸馏水润洗后再离心，重复此过程3次，然后菌体用蒸馏水定容到10mL得到菌液，分别取离心后的上清液、菌液、未离心发酵液各0.5mL进行絮凝率测定，测定其絮凝活性。

1.3.3.3 单菌种絮凝率测定方法 对筛选后的菌种发酵液各取0.5mL，然后加入到0.1%的高岭土悬液中，测定上清液吸光度，以此为依据比较絮凝率。

1.3.3.4 菌种培养时间对絮凝效果的影响 将斜面菌种接种到液体培养基上，30℃、150r/min振荡培养，每一天取样一次，测定其对高岭土悬液的絮凝率。

1.3.3.5 菌种培养温度对絮凝效果的影响 分别吸取不同菌株发酵液20mL，在不同温度，水浴30min，吸取菌种发酵液10mL，测定其对高岭土悬液的絮凝率。

1.3.3.6 不同培养pH条件对絮凝效果的影响 分别吸取不同菌株发酵液20mL，在不同pH条件下，30℃水浴30min，吸取发酵液10mL，测定其对高岭土悬液的絮凝率。

1.3.3.7 最优菌种培养条件正交实验 在温度、pH对絮凝效果影响实验基础上，以高岭土悬液絮凝率为指标，对温度、pH、时间3个因素进行正交实验（L16（43）），确定最优絮凝菌种的培养条件，见表1。

表1 因素水平设计表（L16（43））Table.1 The design table of factor levels（L16（43））

1.3.4 复合菌种絮凝实验 为取得更好的絮凝沉降效果，在单菌种实验的基础上进一步进行复合菌种絮凝实验。各取每种菌种的发酵液1mL，分别两两、三三、四四等进行复配，再取复配后的发酵液0.5mL加入到0.1%的高岭土悬液中。根据马铃薯淀粉实际生产过程中，工艺废水条件，确定在28℃pH=5，放置1h后观察其絮凝效果，并测定絮凝率。

1.3.5 COD值、BOD5值测定 在絮凝效果测定基础上，对马铃薯工艺废水进行单菌种和复配菌种降解效果比较，测定单菌种和复配后菌种COD、BOD5值，比较COD、BOD5的的去除率，COD的测定[4]采用重铬酸钾法；BOD5的测定[5]采用生化需氧量法，COD、BOD5值委托兰州市环境保护局环境监测站测定。

2 结果与分析

2.1 菌种的分离和纯化

从马铃薯淀粉废水中分离提纯出7种不同的絮凝菌株。每种菌种发酵液各取0.5mL，然后加入到0.1%的高岭土悬液中，观察各种菌株发酵液对高岭土悬液的絮凝效果，同时记录絮凝颗粒大且高岭土悬液上层液变为清澈的菌株，测定吸光度，计算絮凝率并筛选出4个高絮凝菌株，命名为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ。

2.2 废水中高絮凝菌种的鉴定

对上述筛选出的菌种进行菌种鉴定，菌种Ⅰ菌落白色，呈平面扩散，有细细的绒毛，镜检观察并结合《真菌鉴定手册》[6]确定是白地霉；菌种Ⅱ菌落颜色为青绿色，有绒毛，镜检观察并结合《真菌鉴定手册》[6]确定是一种青霉菌；菌种Ⅲ有细细的绒毛，在菌落被挑起时中心颜色为红色，镜检时菌种有松散的网络状，根据《真菌鉴定手册》[6]鉴定是一种红曲霉菌；菌种Ⅳ有酒香味，镜检观察并结合《真菌鉴定手册》[6]确定为酵母菌。

在进行起垄的过程中，农户应该对垄宽进行控制，保持起垄宽度在80cm左右，垄顶宽度在54-56cm，垄高为13cm左右，同时也应保持垄顶的平整。在这样的情况下，小行距控制在35cm左右的情况下，每垄可以播种两行花生，每穴播种单粒种子，并将播种深度控制在5cm上下，穴距控制在12cm左右。通过科学的起垄和密植，每亩地块可以种植花生1.4万穴，更好的提升了土地的利用率。

2.3 单菌种絮凝实验

2.3.1 单菌种絮凝活性的分布 实验测定Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ四种菌株的发酵液、上清液、菌液的絮凝活性分布，结果见表2。

表2 絮凝活性测定数据表Table.2 Table of determination data about flocculation activity

从表2得出菌种絮凝率除Ⅱ菌种菌液、Ⅲ菌种菌液及其发酵液和Ⅳ的菌液的离散程度较大外，其余的均小于50%，因此各絮凝率的平均值很可靠[7]。菌体Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ的絮凝活性都是：发酵液＞上清液＞菌液。因此4种菌种的发酵液的絮凝效果最好，而菌液的絮凝效果最差。

2.3.2 单菌种絮凝率测定 在以上实验基础上，对筛选后Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ四个菌种发酵液进行单菌种絮凝率测定，见表3。

表3 单菌种絮凝率测定数据表Table.3 Table of determination data about flocculation rate of single strain

由表3的结果分析可知，Ⅰ菌的发酵液对高岭土悬浮液的絮凝率为92.24%；Ⅱ菌为84.34%；Ⅲ菌为76.60%；Ⅳ菌的絮凝率为80.83%。由此可知，白地霉的絮凝率最高，青霉菌次之，絮凝率最低的是红曲霉菌。

2.3.3 菌种培养时间絮凝效果研究 从图1可以得到，四种菌种在培养2～5d的时间内，都能达到较好的絮凝效果，其中白地霉的絮凝率均大于其他三种菌。

2.3.4 不同温度下菌种的絮凝效果实验 从图2可以得到，四种菌种在10～70℃的范围内，都能达到较好的絮凝效果，而且在常温的情况下（20～35℃）可达到最佳絮凝效果，有利于马铃薯工艺废水处理。相同温度下白地霉的絮凝率均大于其他三种菌。

2.3.5 不同pH条件下各菌种絮凝效果实验 由图3可以看出，pH在中性偏酸性条件下，即在pH4.0～7.5时，4种菌种经培养后的发酵液对高岭土悬液的絮凝率均大于60%，此pH范围符合一般霉菌和酵母菌生长繁殖所需的范围。同2.3.3、2.3.4的实验结果一致，相同pH下，白地霉的絮凝率均大于其他三种菌，因此，选择白地霉为最优絮凝菌种。

图1 4种菌种不同培养时间的絮凝率Fig.1 The flocculating rate of the four strains with different culture time

图2 4种菌种不同温度下的絮凝率Fig.2 The flocculation rate of four stains at different temperatures

图3 4种菌种不同pH下的絮凝率Fig.3 The flocculating rate of the four strains with different pH

2.3.6 最优菌种白地霉培养条件正交实验 由表4可以看出，温度对白地霉絮凝效果影响最大，其次是pH，时间影响最小。白地霉在35℃，pH5.0，培养5d，以此条件做验证实验，絮凝率为92.39%；高于表4中其他组合的絮凝率。

表4 白地霉培养条件正交表L16（43）Table.4 The orthogonal table of Cultural conditions ofgeotrichum candidum.L16（43）

其他3种絮凝菌种做同上正交及验证实验，其最佳培养条件为青霉在35℃pH5.5，培养2d；酵母菌在35℃pH6.0，培养5d；红霉在35℃pH4.5，培养3d，以此条件做验证实验，其絮凝率分别为青霉84.38%，酵母菌81.75%，红霉为78.31%。在此条件下培养的菌种做复配菌种絮凝实验。

2.4 复配菌种絮凝实验

4种菌种进行两两（复配比1∶1）、三三（复配比1∶1∶1）、四四（复配比1∶1∶1∶1）等复配，复配出11种复合絮凝菌种，测定其对高岭土悬液的絮凝率，数据如图4所示。

图4 复配菌种絮凝率Fig.4 The flocculation rate of mixed strains

由图4可以比较出11种复配菌种的絮凝率，结果为：Ⅰ+Ⅱ＞Ⅱ+Ⅲ+Ⅳ＞Ⅱ+Ⅳ、Ⅰ+Ⅳ＞Ⅰ+Ⅱ+Ⅳ＞Ⅰ+Ⅱ+Ⅲ+Ⅳ＞Ⅰ+Ⅱ+Ⅳ＞Ⅰ+Ⅱ+Ⅲ＞Ⅰ+Ⅲ、Ⅱ+Ⅲ＞Ⅲ+Ⅳ。

其中菌白地霉与青霉复配后的絮凝效果最好，絮凝率为92.47%，酵母菌与红曲霉菌复配后的絮凝率最低为78.49%。

2.5 COD、BOD5去除效果分析

在絮凝效果测定基础上，对马铃薯工艺废水进行单菌种和复配菌种降解效果比较，测定COD、BOD5值，比较COD、BOD5的去除率。

2.5.1 单菌种的COD与BOD5去除率 从图5中可以看出，Ⅰ菌（白地霉）的COD和BOD5的去除率最高，分别达到90.32%和86.0%；Ⅲ菌（红曲霉）的COD和BOD5的去除率最低，分别是75.06%和76.0%。

图5 单菌种的COD与BOD5去除率Fig.5 The removal rate of COD and BOD5of single strain

2.5.2 复配菌种的COD与BOD5去除率 从图6可以看出所有复配菌种的COD和BOD5去除率均达到60%以上，最好的复配菌是Ⅰ、Ⅱ（白地霉与青霉），COD去除率93.21%，BOD5去除率90.15%；最差为复配菌Ⅲ、Ⅳ（酵母菌与红曲霉菌），其COD和BOD5分别达到62.31%和60.25%。

图6 复配菌种的COD和BOD5去除率Fig.6 The removal rate of COD and BOD5of mixed strains

3 结论

3.1本研究从马铃薯淀粉工艺废水中分离筛选出4种高絮凝菌株，分别是白地霉、青霉、酵母菌和红曲霉。以高岭土悬浊液为模拟絮凝对象，通过絮凝活性的分布实验4种菌种发酵液的絮凝效果最好。

3.2通过实验表明单菌种絮凝效果为白地霉最好，其培养条件为：35℃pH5.0，培养5d，絮凝率为92.39%。

3.3复合菌种絮凝实验结果表明，复配菌白地霉与青霉菌种的絮凝率最高为92.47%，酵母菌与红曲霉菌种复配的絮凝率最低为78.49%。

3.4对马铃薯工艺废水进行单菌种和复配菌种降解效果比较，其中白地霉对工艺废水中的COD和BOD5去除率最高；复配菌种白地霉与青霉复配后对马铃薯工艺废水中COD去除率为93.21%，BOD5去除率为90.15%，去除率最高。

[1]王有乐，张宝茸，范志明，等.淀粉废水培养复合型微生物絮凝剂产生菌研究[J].工业水处理，2009，29（10）：55-59.

[2]王镇，王孔星，谢裕敏.几株絮凝剂产生菌的特性研究[J].微生物学报，1995，35（2）：121-129.

[3]王宇，任一兵，刘文全，等.微生物絮凝剂产生菌的筛选及絮凝活性的测定[J].攀枝花学院学报，2009（3）：12-13.

[4]国家技术监督局编.水质、化学需氧量的测定、重铬酸盐法（GB 11914-1989）[M].北京：中国标准出版社，1991：1-4.

[5]环境保护部编水质五日生化需氧量（BOD5）的测定、稀释与接种法（HJ 505-2009）[M].北京：中国环境科学出版社，2009：2-9.

[6]魏景超.真菌鉴定手册[M].上海：上海科学技术出版社，1979：105-111，132-135，489.

[7]郝拉娣，于化东.标准差与标准误[J].编辑学报，2005，17（2）：116-118.

Study on the flocculation of high efficient flocculation strain in potato starch wastewater

MA Shu-wen，WANG Ming-ming*
（Life Science and Engineering College，Northwest University for Nationalities，Lanzhou 730124，China）

High effective flocculation strain geotrichum candidum，penicillium，erythromycin，and yeast were isolated from potato starch waste water.Choosing kaolin suspension as the research object，authors had carried out flocculation experiments on single strain and mixed strains，respectively.These cultivation conditions were optimized and the flocculation rate，COD values，and BOD5values were determined in this experiment. The effective flocculation method was found was to be with geotrichum candidum and under the flocculation rate of 92.39%，when single strain was flocculated.Cultivated in waste water medium，the best flocculation effect of geotrichum candidum was achieved under the optimized conditions，which were the temperature of 35℃，the pH of 5.0，and a fermentation time of 5d.The removal efficiencies of COD and BOD5were 90.32% and 86.0%，respectively.In the case of the flocculation of mixed strains，the best flocculation effect was realized with the combination of geotrichum candidum and penicillium，with a flocculating rate at 92.47%.The removal efficiency of COD and BOD5were 93.21%and 90.15%，respectively.

potato starch wastewater；high flocculating strain；flocculation rate

TS201.3

A

1002-0306（2014）04-0170-05

2013－05－24 *通讯联系人

马姝雯（1963-），女，大学本科，副教授，研究方向：农产品深加工。

甘肃省自然科学基金项目（101RJZA081）。