乙醇及有机酸对木醋杆菌合成细菌纤维素的影响

张丽平，卢红梅，*，戴 锐，代来鑫，姜晓琳

（1.贵州大学贵州省发酵工程与生物制药重点实验室，贵州贵阳550025；2.贵州大学化学与化工学院，贵州贵阳550025）

乙醇及有机酸对木醋杆菌合成细菌纤维素的影响

张丽平1，2，卢红梅1，2，*，戴 锐1，2，代来鑫1，2，姜晓琳1，2

（1.贵州大学贵州省发酵工程与生物制药重点实验室，贵州贵阳550025；2.贵州大学化学与化工学院，贵州贵阳550025）

研究了乙醇、草酸、酒石酸、丙酮酸、苹果酸、乳酸、乙酸、柠檬酸、丁二酸对木醋杆菌产细菌纤维素的影响。结果发现：丙酮酸、乳酸、乙酸、乙醇、苹果酸、柠檬酸、丁二酸对木醋杆菌合成细菌纤维素有促进作用；草酸、酒石酸对木醋杆菌合成细菌纤维素有抑制作用；乙醇及各有机酸的最佳添加浓度分别为：丙酮酸0.15%，苹果酸0.1%，乳酸0.3%，乙酸0.4%，柠檬酸0.1%，丁二酸0.2%，乙醇4%；由正交实验得混酸的最适添加配比为：丙酮酸0.1%，苹果酸0.12%，乳酸0.2%，乙酸0.3%，柠檬酸0.12%，丁二酸0.2%，乙醇3%，BC产量达3.012g/L，是空白实验组的2.03倍。

有机酸，乙醇，木醋杆菌，细菌纤维素

细菌纤维素具有纯度高、结晶度高、聚合度高、纳米细度及生物适应性等优良性能[1]，作为一种新型的生物材料可广泛的应用于食品添加剂[2-3]、造纸[4-6]、医药[7-11]等多个领域。目前，在国内，广泛运用于食品中的细菌纤维素主要通过自然发酵椰子水生产。而原料的季节性及自然发酵椰子水成分的复杂性[12]，使细菌纤维素的商业化生产缺乏可控性，产品质量也不稳定。在木醋杆菌产细菌纤维素的实验中发现，用糖化液培养基和化学培养基培养木醋杆菌产细菌纤维素的过程中细菌纤维素的产量不同，研究显示乙醇及有机酸可以增加细菌纤维素的产量[13-16]。考虑到可能因为不同培养基发酵过程中产生的物质不同造成细菌纤维素的产差异，因此本实验对木醋杆菌产细菌纤维素过程中发酵液内有机酸的变化及其增效作用进行研究，期望为进一步探讨增效机理提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

木醋杆菌（Acetobacter xylinum） 贵州大学发酵工程与生物制药重点实验室保藏；纤维素酶活为10000U/g 日本YaKult公司；其他试剂 均为分析纯；液体种子培养基 参照文献[17]；化学培养基 蔗糖50g，酵母膏10g，蛋白胨8g，磷酸二氢钾4.3g，硫酸镁2.5g，蒸馏水1000mL；糖液培养基 贵州省贵阳市味莼园食品有限公司提供的大米糖化液，经四层纱布过滤，滤液与蒸馏水按1∶1稀释，其主要成分为总糖124.63g/L，总酸0.15g/kg，乙醇0.4%。

LD－10ADvp型高效液相色谱、UV－2550型紫外分光光度计 日本岛津公司；雷磁PHS－3C型酸度计 上海精科仪器有限公司；GSY－1型电热恒温水浴锅 北京市医疗设备厂；LXJ－Ⅱ型离心沉淀机 上海医用分析仪器厂；101－1A型电热鼓风恒温干燥箱 沪南电路烘箱厂；SPX－250型生化培养箱。

1.2 实验方法

1.2.1 培养方法 量取50mL化学培养基至250mL三角瓶内，经121℃、20min灭菌后，接入8%的木醋杆菌活化后的种子液，30℃恒温静置培养7d；量取50mL糖液培养基至250mL三角瓶内煮沸、冷却，后接入8%的木醋杆菌活化后的种子液，30℃恒温静置培养7d。

1.2.2 细菌纤维素的处理 收集纤维素，用蒸馏水反复冲洗除去膜表面的培养基及杂质后，置于80℃，0.1mol/L NaOH溶液中，维持2h，以除去菌体蛋白和残余的培养基，至膜呈乳白色半透明状，冷却后用0.1mol/L HCl中和30min，蒸馏水充分洗涤，在80℃下干燥至恒重[18]。

1.2.3 细菌纤维素（BC）产量测定 按1.2.2的方法将细菌纤维素处理干净烘干后称其干重，BC产量通过以下公式计算：

1.2.4 有机酸测定 在静置条件下，每天定时分别取出一定量的两种发酵液，经离心后取上清液，利用高效液相色谱测定发酵液内主要有机酸的含量。

分离条件的确定：首先研究各有机酸的最大吸收峰，确定适宜的检测波长，在此基础上研究流动相中磷酸盐的种类、磷酸盐浓度、流动相pH、峰形改性剂甲醇的含量、流速、柱温对分离效果的影响，最终确定分离条件。

机器参数：分析柱C18，紫外检测波长210nm，流动相是pH为2.8的KH2PO4缓冲液，流速0.5mL/min；进样量10μL，柱温30℃。

标准曲线的绘制：取不同浓度的混标溶液进样，每个浓度重复进样5～6平衡测定，以酸的质量浓度C（mg/mL）对峰面积A作线性回归。

1.2.5 总糖的测定 按照DNS法[19]绘制葡萄糖标准曲线，每天定时检测发酵液中的总糖。

样品处理：取发酵液离心，吸取上清液5mL于100mL容量瓶中加水30mL和盐酸溶液5mL，在70℃水浴中加热水解15min。冷却后用氢氧化钠溶液中和至中性，加水定容至100mL，摇匀，作为水解液备用。

样品测定：吸取水解液1.0mL，置于25mL容量瓶中，各加入DNS试剂2mL，置于沸水浴中煮2min进行显色，然后以流水迅速冷却，用蒸馏水定容，摇匀。以试剂空白调零，在540nm下测定吸光度，与葡萄糖标样作对照，求出样品中糖的含量。

1.2.6 干膜总糖测定 测定时取10mL活化好的纤维素酶上清液加入到盛有细菌纤维素干膜的锥形瓶中，在50℃水浴条件下充分水解2h，适当稀释后测定干膜的总糖浓度。

1.27 糖转化率的计算 通过以下公式计算：

糖转化率（%）=干膜总糖浓度（g/L）/（初始总糖浓度（g/L）-残糖浓度（g/L））×100

1.2.8 混酸增效效果的优化 对各种有增效效果的有机酸及乙醇分别选取了3个水平进行L18（37）正交实验。因素水平表见表1。

表1 混酸正交实验因素水平表Table.1 The level of mixed acid factors for orthogonal test

2 结果与讨论

2.1 不同培养基内细菌纤维素的产量

分别用糖液培养基、化学培养基培养木醋杆菌产细菌纤维素（BC），在发酵结束将BC处理后烘干至恒重，产量对比结果如图1所示。由图1可知，糖液培养基的BC产量为1.64g/L，比化学培养基产量提高了10.66%，这可能是因为糖化液培养基含有乙醇的作用。苟金霞等[14]报道了乙醇能够提高细菌纤维素的产量，也可能是因为糖化液培养基的高含糖量以及其含有的其他营养物质使得发酵液中产生了某些有利于木醋杆菌合成细菌纤维素的物质，因此研究两种培养基早发酵过程中的差异，可为今后BC的实际生产提供相关的理论基础。

图1 不同培养基内的细菌纤维素产量Fig.1 Bacterial cellulose production in different cultures

2.2 不同培养基内有机酸的变化

2.2.1 有机酸的标准色谱图 测定1mg/mL混合有机酸的标准色谱图，8种有机酸均能有效分离，所得图谱如图2所示。

2.2.2 标准曲线 各有机酸的回归方程如表2所示。

图2 有机酸标准液色谱图Fig.2 Liquid chromatography figure of organic acids standard

表2 有机酸的回归分析Table.2 Regression analysis of organic acids

2.2.3 发酵过程中有机酸的变化 发酵液中有机酸的变化结果如图3和图4所示。

图3 化学培养基内有机酸的变化Fig.3 Organic acids changing in the chemical medium

图4 糖液培养基内有机酸的变化Fig.4 Organic acids changing in the sugar liquid medium

如图3所示，在化学培养基中，木醋杆菌代谢产生的5种有机酸，其中以草酸、酒石酸较为突出，在发酵结束后草酸浓度为2.30g/L，酒石酸浓度为2.84g/L；柠檬酸在发酵过程中的浓度始终在0.2g/L左右波动，可能由于在发酵过程中柠檬酸的产生与消耗始终处于一种动态平衡；而乙酸和乳酸的浓度在发酵第2d达到最高值，乙酸浓度为0.26g/L，乳酸浓度为0.32g/L，值得注意的是乙酸在发酵第3d后浓度变得非常的小。因此总体来说在化学培养基内发酵过程中产生的有机酸种类较少且草酸和酒石酸大量累积。

由图4可知，木醋杆菌利用糖液培养基在发酵过程中，代谢产生丰富种类的有机酸并加以利用，其中以柠檬酸和乙酸含量最为突出。马霞等[20]实验证实在培养基中添加醋酸、柠檬酸和乳酸，可以提高BC的产量，在糖液培养基内乙酸浓度同样在第2d达到最高值为1.25g/L，但后期消耗比化学培养基内较为缓慢；同时可注意到草酸、酒石酸的浓度较化学培养基内维持在一个较低的水平；其中柠檬酸浓度的变化趋势与化学培养基内基本一致，但含量较高；丙酮酸也呈现出相同的趋势，其浓度始终维持0.2g/L左右。

结合图3和图4可知，由于糖液内有机酸种类较为丰富，而草酸和酒石酸的浓度较低，如此可推测在糖液培养基中BC产量较高的原因，可能是由于木醋杆菌在不同培养基中培养时代谢机理有差异，化学培养基中的累积产物如草酸、酒石酸对木醋杆菌产细菌纤维素有抑制作用。为了对此推测进行验证，选择在培养基内添加各种有机酸研究其作用，并与添加乙醇和空白实验组进行对照。而因为糖液培养基的成分较复杂，不好控制，所以选择化学培养基进行研究。

2.3 不同添加物的增效效果

在化学培养基内分别添加0.1%的草酸、酒石酸、丙酮酸、苹果酸、乳酸、乙酸、柠檬酸及TCA循环的中间产物丁二酸和1%的研究相对较多的乙醇，同时以不添加物质的化学培养基作为空白进行对照，在发酵结束后测定细菌纤维素（BC）干膜的质量，结果如图5所示。

图5 不同添加物在化学培养基中对细菌纤维素产量的影响Fig.5 Effect of different additives on the yield of bacterial cellulose in the chemical medium

由图5可知，草酸、酒石酸对BC的合成有明显的抑制作用，结合图3和图4即验证了在化学培养基内草酸和酒石酸的积累对BC的产量有一定的影响；丙酮酸、乳酸、乙酸、乙醇对BC的增效作用较为明显，BC产量比空白实验（1.482g/L）分别增加了37.85%、32.25%、36.17%、30.09%，丙酮酸作为TCA循环和糖异生作用的前提物质对BC合成有明显的增效作用，而乳酸、乙酸、乙醇在发酵过程中均属于被快速消耗的非碳水化合物，因此在培养基内添加有较好的增效效果；苹果酸、柠檬酸、丁二酸的增效效果不明显，它们作为TCA循环的中间产物，可能由于在木醋杆菌发酵过程中自身产生的浓度已足够其合成供给，或者添加浓度较低，使得增效效果并不显著，后面将会对有乙醇和有增效作用有机酸的添加浓度进行优化。

2.4 添加乙醇及不同有机酸的糖转化率

添加不同物质后糖的转化率是衡量此物质是否有益于木醋杆菌合成细菌纤维素（BC）的较好标准，因此在化学培养基内分别添加0.1%的草酸、酒石酸、丙酮酸、苹果酸、乳酸、乙酸、柠檬酸、丁二酸和1%的乙醇考察期对糖的转化率的影响，结果如表3所示。

表3 添加不同物质后的糖转化率Table.3 Sugar conversion rate after adding different materials

表3表明在培养基中添加丙酮酸、乳酸、乙酸、柠檬酸、乙醇均能提高木醋杆菌合成BC的糖转化率，分别为12.126%、14.735%、17.804%、11.163%、20.654%，其中以乙醇和乙酸最为突出，是生产中理想的增效因子；添加苹果酸、丁二酸虽能将产量有所提高，但效果不显著且转化率与空白实验的10.854g/kg相比偏低；而添加草酸、酒石酸无论是产量还是转化率均低于空白实验，因此属于合成BC的抑制因素。

2.5 不同浓度有机酸及乙醇的增效效果

为探究各有机酸及乙醇的添加量对增效效果的影响，本实验选用除草酸和酒石酸外具有增效作用的乙醇及其他有机酸进行研究，图6～图12为不同增效因子的单因素实验结果，由此可知各有机酸及乙醇的最佳添加浓度分别为：丙酮酸0.15%，苹果酸0.1%，乳酸0.3%，乙酸0.4%，柠檬酸0.1%，丁二酸0.2%，乙醇4%，对应的细菌纤维素的产量为：2.192、1.726、2.12、2.526、1.666、1.884、2.626g/L，而空白实验组的细菌纤维素产量为1.482g/L。这进一步证实了由糖的利用率推测得到的结果，其中乙醇和乙酸是最为理想的增效因子。

图6 不同浓度丙酮酸的BC产量Fig.6 BC production in different pyruvate concentration

图7 不同浓度苹果酸的BC产量Fig.7 BC production in different malic acid concentration

图8 乳酸浓度对BC产量影响Fig.8 BC production in different lactic acid concentration

图9 乙酸浓度对BC产量影响Fig.9 BC production in different acetic acid concentration

图10 柠檬酸浓度对BC产量影响Fig.10 BC production in different citric acid concentration

图11 丁二酸浓度对BC产量影响Fig.11 BC production in different succinic acid concentration

图12 乙醇浓度对BC产量影响

Fig.12 BC production in different ethanol concentration

2.6 混酸的增效效果

对有增效作用的乙醇及其他有机酸的正交实验结果如表4所示。

表4 混酸正交实验设计与直观分析结果Table.4 Orthogonal experiment design and analysis result of mixed acid

通过表4中极差分析可知，添加物对细菌纤维素产量的影响因素按主次顺序排列为：G＞A＞B＞F＞E＞D＞C，即乙醇＞丙酮酸＞苹果酸＞丁二酸＞柠檬酸＞乙酸＞乳酸。根据正交实验结果可确定最佳添加方式为：A1B3C1D1E3F2G1，即丙酮酸0.1%，苹果酸0.12%，乳酸0.2%，乙酸0.3%，柠檬酸0.12%，丁二酸0.2%，乙醇3%。在优化出的最佳条件下进行实验，经三次平行实验取平均值后得到的最佳产量为3.012g/L，高于表4中其他组合的BC产量。

3 结论

草酸和酒石酸对木醋杆菌合成细菌纤维素有抑制作用，而其余物质均有促进作用，其中乙醇作用最为显著；单一添加各有机酸及乙醇的最佳浓度分别为：丙酮酸0.15%，苹果酸0.1%，乳酸0.3%，乙酸0.4%，柠檬酸0.1%，丁二酸0.2%，乙醇4%；混酸的最适添加配比为：丙酮酸0.1%，苹果酸0.12%，乳酸0.2%，乙酸0.3%，柠檬酸0.12%，丁二酸0.2%，乙醇3%，BC产量达3.012g/L，是空白实验组的2.03倍。后期将对增效作用较为明显的乙醇和乙酸的增效机理进行研究，为细菌纤维素的规模化生产提供一定的参考。

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Study on the function of ethanol and organic acid to Acetobacter xylinum synthetic bacterial cellulose

ZHANG Li-ping1，2，LU Hong-mei1，2，*，DAI Rui1，2，DAI Lai-xin1，2，JIANG Xiao-lin1，2
（1.Guizhou Province Key Laboratory of Fermentation Engineering and Biopharmacy，Guizhou University，Guiyang 550025，China；2.College of Chemistry and Chemical Engineering，Guizhou University，Guiyang 550025，China）

The influence of ethanol，oxalic acid，tartaric acid，pyruvic acid，malic acid，lactic acid，acetic acid，citric acid，succinic acid on Acetobacter xylinum producing bacterial cellulose were studied.These results showed that：pyruvic acid，lactic acid，acetic acid，ethanol，malic acid，citric acid and succinic acid had stimulative effect on Acetobacter xylinum producing bacterial cellulose.Oxalic acid and tartaric acid had inhibitory effect on Acetobacter xylinum producing bacterial cellulose.The optimum additive concentration of ethanol and organic acids were as follows：pyruvic acid 0.15%，malic acid 0.1%，lactic acid 0.3%，acetic acid 0.4%，citric acid 0.1%，succinic acid 0.2%，ethanol 4%.By the orthogonal experiment the optimum proportion of mixed acid were as follows：0.1%pyruvic acid，malic acid 0.12%，0.2%lactic acid，acetic acid 0.3%，citric acid 0.12%，succinic acid 0.2%，3%ethanol.The BC production was 3.012g/L，which was 2.03 times of blank group.

organic acid；ethanol；Acetobacter xylinum；bacterial cellulose

TS201.3

A

1002-0306（2014）04-0161-06

2013－05－23 *通讯联系人

张丽平（1987-），女，硕士研究生，研究方向：食品生物技术。

国家自然科学基金（31160338）；贵州省科学技术基金（黔科合字[2010]2066）。