传统四川泡菜发酵过程中明串珠菌的分离鉴定

夏 姣，蒲 彪，敖晓琳，陈安均，崔慧玲，袁 杨

（四川农业大学食品学院，四川雅安625114）

传统四川泡菜发酵过程中明串珠菌的分离鉴定

夏 姣，蒲 彪*，敖晓琳，陈安均，崔慧玲，袁 杨

（四川农业大学食品学院，四川雅安625114）

分别以红皮萝卜、卷心菜、豇豆为原料，用自然发酵法制作了三种四川泡菜。对三种泡菜发酵过程中的明串珠菌进行分离，主要得到四种不同形态的菌株，将其分别命名为：MC-1、MC-2、MC-13、J-5，其中J-5为豇豆泡菜特有，其余为三种泡菜共有。采用生理生化结合16SrDNA序列鉴定对分离的菌株进行鉴定，依次鉴定为：乳明串珠菌（L.lactis）、肠膜明串株菌葡聚糖亚种（L.mesenteroides subsp.dextranicum）、柠檬明串珠菌（L.citreum）、假肠膜明串珠菌（L.pseudomesenteroide）。对发酵过程中明串珠菌动态分析表明：L.lactis、L.mesenteroides subsp.dextranicum为三种泡菜中的主要优势明串珠菌；L.citreum在发酵第2～4d出现后很快又消失；L.pseudomesenteroide在豇豆发酵的第3～9d比较活跃；泡菜发酵到第11d，泡菜水中所有的L.lactis都消失。

四川泡菜，明串珠菌，16SrDNA，动态变化

四川泡菜是以蔬菜为原料，添加或不添加辅料，在多种微生物作用下经盐水泡制而成的发酵蔬菜，其味道咸酸爽口，自然清纯，既可以作为佐餐食用，也可以作为调味菜食用。泡菜具有净肠、抗菌、抗癌、抗衰老、抗动脉硬化和抗肥胖、抗突变活性和预防脑溢血等作用[1]，是世界公认的三大健康发酵蔬菜腌制品之一。明串珠菌（Leuconostoc）是一类进行异型发酵的革兰氏阳性、耐氧的乳酸细菌，其属内包括肠膜明串珠菌（L.mesenteroides）、乳明串珠菌（L.lactis）、柠檬明串珠菌（L.citreum）、假肠膜明串珠菌（L. pseudomesenteroide）等13个种[2]。在泡菜发酵初期，明串珠菌比较活跃。Pederson曾指出启动泡卷心菜发酵的菌种为肠膜明串珠菌[3]。目前，关于泡菜中的乳杆菌有大量的研究，而对明串珠菌研究很少，只有部分学者分离到肠膜明串珠菌。本实验以三种蔬菜（红皮萝卜、豇豆、卷心菜）为原料制作泡菜，对其发酵过程中存在的明串珠菌进行分离鉴定，旨在分析泡菜发酵过程的明串珠菌菌群及其动态变化，为泡菜工业化生产过程中发酵菌种的选择提供初步依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

土墙温室跨度大，荷载重，因此，对骨架要求比较严格。对于无立柱日光温室，骨架荷载能力比较弱的，加立柱，根据骨架结构和材料，东西方向每4-6m加一钢立柱或水泥立柱。对于钢架和竹片(PVC管)混搭的骨架，全部更新为1m间隔的钢骨架。具有的骨架改造也可以根据日光温室的实际情况选择改造方法。

红皮萝卜、豇豆、卷心菜 雅安市售；2×PCR Master Mix、离心柱型细菌基因组DNA提取试剂盒北京天根生物科技有限公司；蔗糖硫胺培养基、MRS培养基、PY培养基、PYG培养基、葡聚糖生成培养基、糖类发酵实验基础培养基、葡萄糖产气实验用培养基 按文献[4]配制。

Powerpac Basic电泳仪、Universal HoodⅡ凝胶成像系统、MycyclerTMThermal Cycler PCR仪 美国BIO-RAD公司；CX21S1电子显微镜 日本OLYMPUS公司；YXQ.SG41.280高压蒸汽灭菌锅 上海华线医用核子仪器有限公司；SW-CJ-IF单人双面超净工作台 苏净安泰空气技术有限公司。

表1 菌落形态特征及个体特征Table.1 Colony morphology and microscopy morphology

1.2.5 明串珠菌种类动态分析 分别取发酵1、2、3、4、5、6、7、9、11、13d卷心菜泡菜水、红皮萝卜泡菜水、豇豆泡菜水来进行明串珠菌的动态分析。取合适稀释度的泡菜水涂布于蔗糖硫胺平板上，于25℃恒温培养箱培养48h后观察菌落形态，并对菌落形态进行记录。

用外圆内方来概括全新路虎发现非常恰当，而圆与方抛开形似外更有哲学层面的意义。圆更符合这个时代人们对于传统汽车外形的共同认知，方则体现着路虎并不愿彻底向时代让步从而忘却经典本真。从哲学层面的意义来理解，全新路虎发现并没有失去人们曾经喜欢的那种类似工具车的硬派与酷，如今的它只是将曾经外露的性格藏在了车内。

1.2.1 泡菜制作 将蔬菜原料（红皮萝卜、豇豆、卷心菜）清洗、切分、晾干后分别放入泡菜坛中，以料液比1∶2（g/mL）加入盐浓度为6%的灭菌盐水于室温条件下发酵。

1.2.2 泡菜汁中明串珠菌的分离筛选 取不同发酵时期的泡菜液作梯度稀释后，涂布于蔗糖硫胺固体培养基，于25℃恒温培养箱中培养48h后，挑取不同形态的单菌落在溴甲酚紫-蔗糖硫胺培养基（添加5～10mL 0.1%溴甲酚紫）上划线，纯化2次，将能产酸且菌落形态明显的菌株进行革兰氏染色、镜检和H2O2酶测定。选革兰氏阳性、H2O2酶阴性且镜检形态为球形或椭球形的菌株保种。

1.2.3 菌株的鉴定

图1为压电振动能量俘获系统的典型架构。压电振动能量转换装置将环境振动能转换为交流电能,整流器将交流电转换为直流电。第3级中的电压变换模块用于调节直流电压,提高电压品质,以满足负载需求。压电振动能量俘获系统的效率主要取决于整流器及电压变换的效率。因此,提高整流器的工作效率对于压电振动能量俘获系统而言至关重要。

PCR扩增程序：94℃预变性3min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共30个循环；最后72℃延伸5min。

PCR扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检验，目的片段长度在1.5kbp左右。PCR扩增产物送华大基因测序。

1.2.3.2 分子方法鉴定 用试剂盒提取菌株的总DNA，以27f、1492r为引物对扩增菌株16SrDNA序列。其引物序列：正向引物27f：5′-AGAGTTTGATCCTGG CTCAG-3′；反向引物1492r：5′-GGTTACCTTGTTAC GACTT-3′[6]。

简言之，家庭、战争和性别身份给萧红和伍尔夫带来了种种的创伤经历和创伤记忆，而文学书写成为两位作家表达创伤痛苦、打破创伤沉默的方式。无论是萧红碎片化的叙事呈现还是伍尔夫的意识流创作手法，不断打破叙事时间的连贯性、叙事人物的一致性和叙事结构线性发展的都是反复出现的创伤记忆。犹如创伤的记忆不断侵入作者的意识一般，这些创伤的记忆一再侵入情节的发展之中，也因此打破了叙事的连贯性，使得作品叙事呈现出碎片化的表征。

1.2.3.1 生理生化鉴定 生化鉴定方法参照文献[4-5]，根据菌株的培养形态特征及生理生化特性初步确定其分类地位。

经历了这些劫难，沈老七可以说是一贫如洗。刘二自然也出了沈家的门。他并没有再回老家，而是在张满春的撮合下，到河口一陈姓人家做了上门女婿。那丫头长得硕实，且有一双没有被缠裹过的大脚，比刘二小九岁。

由于微课程需要在手机中运行，因此设计微信微课程时应该充分考虑智能手机的性能，学习者善于接受的学习方式等特点，基本的设计原则有以下几点：

1.2.4 系统发育树分析 将菌株的16S rRNA基因序列提交到GenBank核酸序列数据库并与数据库中已知的相关序列进行比较，将相似度高的序列与测定序列通过Clustalx进行多重序列比对，比对结果用MEGA软件中的Neighbor-Joining法构建系统发育树[7]。

1.2 实验方法

2 结果与分析

2.1 菌株的形态特征

对不同蔬菜（红皮萝卜、卷心菜、豇豆）泡制过程中明串珠菌种类的动态变化进行记录，所得结果如表3所示。由表3可以看出，J-5（L.pseudomesenteroide）是泡豇豆中特有的明串珠菌，而MC-1、MC-2、MC-13为三种泡菜共有，且泡菜泡制7d后泡菜水中明串珠菌逐渐消失。

在蔗糖硫胺培养基表面挑选出四株有明显菌落形态、革兰氏阳性、H2O2酶阴性、产酸明显的菌株，分别编号为：MC-1、MC-2、MC-13、J-5。其溴甲酚紫-蔗糖硫胺培养基上的菌落形态特征及个体形态特征见表1，照片见图1。2.2 生理生化特性

图1 菌落形态特征及个体特征Fig.1 Colony morphology and microscopy morphology

各菌株1℃、37℃、pH=4.8的生长情况、耐盐性和乙醇耐受力、葡聚糖产生、运动性、葡萄糖产酸产气、多种碳水化合物发酵情况，结果见表2。结果来看，MC-2可利用蔗糖产生葡聚糖，不发酵阿拉伯糖和甘露醇，依据参考文献[4-5]，其可能为肠膜明串株菌；MC-13和J-5能发酵阿拉伯糖、麦芽糖、果糖，不发酵乳糖，1℃不生长，不能利用蔗糖产葡聚糖，其可能为柠檬明串珠菌或假肠膜明串珠菌；而根据MC-1以上的生理生化特性还不能将其鉴定出来。

表2 菌株生理生化特性Table.2 Physico-chemical characteristics

2.3 16SrDNA鉴定

提取的实验菌株基因组DNA用1%琼脂糖电泳检测，得到了一条明显的亮带，说明所采用提取DNA的方法准确有效。将所得DNA作为模板进行16SrDNA PCR扩增，扩增产物中有1500bp目的条带，且清晰可见，无杂带，可用于菌株16SrDNA测序。供试菌基因组DNA电泳图和PCR扩增产物电泳图分别见图2、图3。

图2 基因组DNA电泳结果Fig.2 Electrophoresis of genomic DNA

图316SrDNA电泳结果Fig.3 Electrophoresis of16Sr DNA

测序结果在NCBI基因序列数据库通过BLAST比对，以酒类酒球菌序列作为外源菌序列，连同同源性较高菌株的序列构建系统发育树。结果见图4。

图416SrDNA系统发育树Fig.4 Phylogenetic tree derived from 16S rDNA sequences注：L.：Leuconostoc。

由构建的系统发育树来看，实验分离的菌株均属于明串珠菌属，其中MC-1与L.lactis（HF562949）和L.lactis（EU419609）聚在一起，且它们的相似度达到99%以上，因而MC-1被鉴定为乳明串珠菌。MC-13与L.citreum（HF562953）同源性达到100%，被鉴定为柠檬明串株菌。J-5与L.pseudomesenteroide（AB795647）聚在一起，为假肠膜明串珠菌。而MC-2与L. mesenteroides subsp.mesenteroides（AB680071）和L. mesenteroides subsp.dextranicum（HF562942）聚在一起，其可能为肠膜明串珠菌肠膜亚种或肠膜明串珠菌葡聚糖亚种，结合MC-2之前的生理生化特性，将其鉴定为肠膜明串珠菌葡聚糖亚种。

泼尼松是一种糖皮质激素类药物，可以显著增强抗炎功效，对毛细血管扩张和增生发挥抑制作用，有效减轻炎性因子对神经节的破坏，血管通透性降低，并且可以有效避免瘢痕。

分离菌株MC-1、MC-2、MC-13、J-5的16SrDNA序列已注册到NCBI数据库，其登录号依次为KF150180、KF150179、KF150181、KF150182。

表3 明串珠菌的动态变化Table.3 Dynamic change of Leuconostoc

2.4 不同泡菜中明串珠菌的动态变化

PCR扩增体系：2×PCR Master Mix 12.5μL、引物各1μL、模板DNA1μL、ddH2O补至25μL。

4) 将 windML_INTEL_GMCH_DB.cfg 文件放置在C:Tornado221host esourcewindMLconfigdatabase 路径下(本文假设VxWorks 开发环境安装在 C:Tornado221 路径下);

泡菜泡制第1d，MC-1、MC-2开始活跃，分别在第9、7d开始出现消减趋势，直到发酵第11d，才全部消失，其可能为泡制前期的优势菌种；MC-13只出现在发酵第2～4d，且出现后随即消失；J-5在豇豆泡制3～9d均有检出，而在其他泡菜中未检测到。此外，三种不同蔬菜发酵过程中出现的明串珠菌种类及其动态变化大致相同，由于自然发酵泡菜中微生物主要来自蔬菜原料，这说明存在于不同蔬菜原料的明串珠菌种类大致相同。

3 讨论

3.1 泡菜中明串珠菌的种类分析

实验从不同的蔬菜（红皮萝卜、卷心菜、豇豆）发酵过程中分离到了四株明串珠菌，分别为乳明串珠菌（L.lactis）、肠膜明串珠菌（L.mesenteroides）、柠檬明串株菌（L.citreum）、假肠膜明串珠菌（L. pseudomesenteroide）。

乳明串珠菌主要分离自乳和乳制品，薛永春等[8]、张敏等[9]、李少英等[10]从不同地区的乳及乳制品中分离到了乳明串珠菌，葛菁萍等[11]在传统豆酱发酵过程中检测出了乳明串珠菌。而贺卫华等[12]、王福金等[13]则分别从碳酸饮料和日粮中分到了假肠膜明串珠菌。关于从泡菜中分离到L.lactis、L. pseudomesenteroide未见报道。这可能与研究泡菜取样的时间间隔及所采用培养基不同有关，大部分学者对于泡菜乳酸菌的研究一般只取发酵过程中的某几个点或直接取发酵成熟的样品进行研究，而采用的培养基则常为MRS培养基，而明串珠菌在泡菜发酵过程中主要活跃于前期或中期，且在MRS培养基上的形态特征不明显。

Choi等[14]、Hyun等[15]从韩国泡菜中分到了柠檬明串珠菌，而国内未见相关报道。可能是由于柠檬明串珠菌不是国内泡菜发酵过程中的优势菌，其存在于泡菜中的时间较短所致。肠膜明串珠菌是泡菜发酵前期的优势菌，国内外已有多位学者从泡菜中分离到了该菌，如Eom等16]、燕萍梅等[17]。

3.2 明串珠菌动态分析

实验分离所得的四株菌在蔗糖硫胺平板上有明显不同的菌落形态。MC-1、MC-2能利用蔗糖产生粘性物质而导致其菌落形态跟之前报道[18]的形态不一样。MC-13在蔗糖硫胺培养基上的形态呈多皱的辐射状，使得与J-5、MC-1、MC-2菌落很好区分。虽然蔗糖硫胺培养基对于明串珠菌是半选择性培养基，但是实验分离菌在该平板上的菌落形态特征很明显，同时在明串珠菌属内，能利用蔗糖产生粘性物质的菌种类也有限。所以该研究关于明串珠菌动态分析结果有一定可靠性。

该研究中肠膜明串珠菌在泡菜发酵的第7d开始消失，与Tao Xiong等[19]研究中肠膜明串珠菌在泡菜发酵第5d开始消失较接近。明串珠菌在泡菜发酵的1～7d比较活跃，后逐渐消失，与国外学者得出的泡菜发酵由明串珠菌启动这一结论相符合[20]。

3.每个队员摸一次，摸球时不准看，每次摸球后都要放回箱子，负责拿箱子的同学晃动箱子，使球混合均匀，接着再摸，摸出红球多的为胜。

4 结论

实验从三种泡菜发酵过程中分离到四种明串珠菌MC-1、MC-2、MC-13、J-5，其依次为乳明串珠菌（L.lactis）、肠膜明串株菌葡聚糖亚种（L.mesenteroides subsp.dextranicum）、柠檬明串珠菌（L.citreum）、假肠膜明串珠菌（L.pseudomesenteroide）。除了豇豆泡菜以外，其他两种泡菜水中均未检测到假肠膜明串珠菌。此外，三种泡菜发酵过程中明串珠菌的动态变化种类及其变化趋势大体一致。

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Separation and identification of Leuconostoc during the fermentation of sichuan pickles

XIA Jiao，PU Biao*，AO Xiao-lin，CHEN An-jun，CUI Hui-ling，YUAN Yang
（College of Food，Sichuan Agricultural University，Ya’an 625114，China）

The Leuconostoc throughout spontaneous fermentation of three kinds of Sichuan pickles were analyzed.Four strains of different colony morphology were separated，and named MC-1，MC-2，MC-13，J-5. J-5 only existed in the bean pickle，others existed in all kinds of pickles.After some physiological and biochemical tests and sequencing the 16SrDNA sequence of the four strains，MC-1 was identified as L.lactis，and MC-2 was L.mesenteroides subsp.dextranicum，MC-13 was L.citreum and J-5 was L.pseudomesenteroide. Dynamic results showed that L.lactis and L.mesenteroides subsp.dextranicum were the dominant Leuconostoc，they presented in the brine as soon as vegetables pickled，L.citreum presented in the 2～4th day and disappeared soon，L.pseudomesenteroide existed in 3～9th day.All the L.lactis disappeared till the 11th day.

sichuan pickle；Leuconostoc；16SrDNA；dynamic change

TS201.3

A

1002-0306（2014）04-0153-05

2013－07－08 *通讯联系人

夏姣（1987-），女，在读硕士研究生，研究方向：果蔬加工理论与技术。

国家自然科学基金资助项目（31171726）。