不同大豆原料形成蛋白纤维聚合物的比较
2014-02-25董世荣徐红华郭珊珊高育哲鞠婷婷
董世荣,徐红华,郭珊珊,高育哲,鞠婷婷
(东北农业大学食品学院,黑龙江哈尔滨150030)
不同大豆原料形成蛋白纤维聚合物的比较
董世荣,徐红华*,郭珊珊,高育哲,鞠婷婷
(东北农业大学食品学院,黑龙江哈尔滨150030)
4种通过不同加工处理得到的大豆蛋白,在低pH条件下90℃加热10h所形成的聚合物形态存在很大不同。利用硫磺素T(Th T)荧光强度、差量扫描仪(DSC)和SDS-PAGE凝胶电泳分析了来自不同原料大豆蛋白的聚合动力学和组成差异。结果表明,4种大豆原料因其加工工艺不同,蛋白质组成存在差异,在本实验的条件下,11S的存在尤其是碱性亚基会抑制纤维聚合物的形成。此外,离子强度也是纤维形成的一个必要条件。
纤维,聚合物,大豆蛋白,聚合动力学
食品蛋白质通过热聚合形成的聚合物对其功能性质有很大改善,并在食品工业中有着广泛的应用,许多研究也主要集中在蛋白质的聚合能力和聚合程度的控制方面,但这种聚合主要是在中性或高于等电点的介质环境中完成的。近些年,低于等电点形成的纤维状蛋白质聚合物引起了人们的关注,如:乳清蛋白、β-乳球蛋白等可食用动物性蛋白质可以在pH2.0附近形成直径在几纳米的纤维聚合物,这种纤维聚合物可以明显改变蛋白质的粘性和凝胶特性[1-2];很多植物蛋白质在低pH条件下通过热处理也同样可以形成纤维聚合物,如:燕麦蛋白[3]、芸豆蛋白[4]等。Kkermans等研究发现7S和大豆分离蛋白在pH2.0、85℃长时间加热可以形成纤维[5];Tang等研究发现7S在pH2.0、80℃长时间加热也可以形成纤维[6];随后Wang等将7S的亚基α′、α和β-亚基分离出来,在pH2.0、85℃加热可以形成不同形态的纤维聚合物[7]。针对目前的研究现状,本文选用了3种成本低廉的市售大豆产品为原料,以自制的未经过热处理的大豆蛋白为对照,利用文献提供的常规方法制备大豆蛋白纤维,希望通过比较不同原料在形成纤维方面的差异,为现有大豆产品拓展新的应用领域。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
3种原料 哈尔滨高科技有限公司:大豆分离蛋白SPIA(蛋白质80.75%,灰分0.185%),大豆分离蛋白SPIG(蛋白质89.69%,灰分0.1196%),低温脱脂豆粕粉TZ(蛋白质49.44%,灰分0.1144%);自制原料ZZ利用组织捣碎机将大豆磨碎,过60目筛,按照国标G2906-82进行脱脂,样品自然干燥得到自制脱脂豆粉(蛋白质49.44%,灰分0.0891%)。
DS-1型高速组织捣碎机 上海精科实业有限公司;GL-21M型高速冷冻离心机 上海精密仪器研究所;JEM-1200EX型透射电子显微镜 日本日立F-7650;硫磺素T(Th T) 美国Sigma-Aldrich公司;F-4500型荧光分光光谱仪 日本HITACHI;PE Pyris差示扫描量热仪 美国PE公司;DTT-6C型电泳仪 北京六一仪器厂。
1.2 实验方法
1.2.1 大豆蛋白纤维的制备 参考Akkermans等[5]的方法并加以改进,确定了大豆蛋白纤维的制备方法如下:将原料溶于去离子水中,将pH调制2.0(2mol/L HCl和0.1mol/L HCl),15000×g离心20min(20℃),取上清液,利用凯氏定氮法测定蛋白含量,用去离子水稀释,使蛋白质质量浓度为10mg/mL,再次调整pH至2.0(2mol/L HCl和0.1mol/L HCl),90℃水浴10h,立即冷却,4℃冰箱保存过夜。4种原料的大豆蛋白在制备纤维的过程中,所有的步骤均保持一致。
1.2.2 透射电镜(TEM) 参考Mark等[8]的方法,使用透射电子显微镜(TEM)(放大2×104倍)测定样品的微观结构。将热处理后的大豆蛋白样用去离子水稀释成质量浓度为3mg/mL,取一滴稀释液滴于透射电镜专用铜网上吸附15min,多余的部分用滤纸移除,室温下干燥10min,采用80kV电压下用透射电镜进行分析。
1.2.3 Th T荧光分析 将8mg Th T溶于10mL磷酸缓冲溶液(0.01mol/L,pH7.0,0.15mol/L NaCl)中制得Th T储藏液[9]。充分溶解后用0.2μm的针头过滤器滤除不溶Th T。Th T储藏液用金属箔于4℃的冰箱中密封避光保存,保存期不超过一周。实验前,将储藏液用相同的磷酸缓冲液稀释50倍后制得工作液[10-11]。将120μL待测样品于10mL Th T工作液混合,振荡混匀后反应1min后进行测量。将仪器的激发波长设定在460nm,发射波长在490nm,激发波长狭缝为10nm,发射波长的狭缝间隙为5nm[12],测定其荧光强度。
1.2.4 聚合动力学 采用Morris等[13]的经验公式,在Th T荧光强度数据拟合的式(1)中,ft是在加热t时间时的荧光强度值,α、β和γ是常数。
tlag是成核期,t1/2max是荧光强度值增大到最大值一半的时间;(df/dt)max是荧光强度增大的最大速率[14]。
1.2.5 DSC的测定[15]DSC的测定是通过差量扫描仪进行测定。根据具体实验条件如下:起始温度:20℃,保持1min;终止温度:180℃,保持1min;升温速度:10℃/min;冷却物质:液氮;降温速度:30℃/min;取样品5mg于专用的液体铝盒内,进行实验。
1.2.6 SDS-PAG凝胶电泳[16]将4种原料配制成溶液15000×g离心20min处理后进行SDS-PAGE凝胶电泳,分析4种原料的组分差异。根据Laemml等方法加以改进,实验中分离胶质量浓度为12%、浓缩胶质量浓度为5%(w/v)。将4种原料溶液(蛋白质量浓度为1.0%(w/v)用缓冲液(10mmol/L Tris/HCl,1mmol/L EDTA,pH8.0)稀释5倍之后,取20μL该稀释液和20μL的0.1%(w/v)的溴酚蓝充分混合,取5μL该混合液上样,浓缩胶采用的电压为60V,分离胶采用的电压为90V,最后用0.1%(w/v)的考马斯亮蓝染色。通过电泳分析4种原料的组成成分的差异。
1.2.7 统计分析 每次实验重复3次。数据统计采用Statistix 8.1进行ANOVA单因素方差分析,数值以平均值±标准差表示。
2 结果与分析
2.1 聚合物形态差异
4种不同大豆原料(SPIA、SPIG、TZ和ZZ)在90℃加热处理10h形成的聚合物形态如图1所示。SPIA可以形成细而长的淀粉样纤维(图1a);SPIG的聚合物形态是带有枝杈状的团簇聚合物(图1b);TZ形成了棉絮状的聚合物(图1c);ZZ原料形成聚合物的形态为粗而长的无规则聚合物(图1d)。结果表明,从不同原料中获取的大豆蛋白,在相同的处理条件下,形成的聚合物形态存在很大不同,聚合物形态的差异可能与原料前期处理条件的不同有关。
图1 不同大豆原料在低pH条件下聚合物的形态差异Fig.1 The morphologies of different soy proteins aggregates at low pH
2.2 聚合动力学
图2 不同大豆原料热处理过程中Th T荧光强度的变化Fig.2 Thioflavin T(Th T)fluorescence of diferent soy materials during heating times
纤维的形成主要分为3个时期:成核期、增长期和稳定期,热处理过程中Th T荧光强度的变化可以反映纤维聚合物的聚合状态,同时,根据式(1)可以拟合出相应的动力学参数[17]。从图2和表1所示的结果中可以看出,不同原料存在很大差异,与其他3种原料相比,SPIA原料的Th T结果最高,fmax高出SPIG原料137.07%和TZ原料49.53%,并且,加热过程中SPIA的(df/dt)max值也要远远大于其他3种原料。说明SPIA的纤维聚合速率和聚合量都远高于其他3种原料,而未经过任何热处理的自制原料并未表现出益于纤维形成的趋势,因此,不同原料的聚合方式与前期不同的处理过程可能存在一定的关系,大豆蛋白的组成和变性程度可能与纤维的形成存在一定关系。
表1 不同大豆原料的蛋白质聚合动力学参数Table.1 Protein aggregates kinetic parameters of different soy materials
2.3 DSC
为了比较不同大豆原料中蛋白质的变性程度,我们研究了4种原料变性温度和焓变值。从表2的结果可以看出,4种原料之间的变性温度和焓变值存在差异。相关文献报道,7S和11S的变性温度分别在70℃和90℃左右[18]。SPIA和SPIG的变性温度主要集中在7S的变性温度,而TZ和ZZ原料则存在7S和11S两个变性温度,这可能是因为SPIA、SPIG经过了碱溶酸沉等工艺处理,使得11S的含量降低,而TZ和ZZ经过加工处理较为简单,11S的含量损失较少。电镜的结果显示SPIA可以形成纤维,这与文献中报道的7S比11S更具有纤维化的潜力相一致[6]。从焓变值的结果可以看出,经过越复杂工艺处理7S焓值越小,蛋白质的适度变性有可能有利于纤维状聚合物的形成。
表2 热处理前后不同大豆原料的DSC结果Table.2 The results of DSC for different soy materials for heating and unheating treatment
2.4 蛋白质组成
图3 不同大豆原料蛋白质组成差异Fig.3 The protein composition from different soy materials
从图3的结果可以看出,4种原料的组分存在很大差异,SPIA和SPIG与TZ和ZZ相比缺少11S的碱性亚基,同时,7S的β-亚基也有所减少。这可能是因为SPIA和SPIG两种原料经历了碱溶酸沉等过程,使得11S的碱性亚基减少甚至消失,在加工热处理过程中7S的β-亚基也有部分的损失[18]。从电镜、Th T荧光强度都显示SPIA可以形成纤维,而TZ、ZZ不能形成纤维,11S的碱性亚基的存在有可能不利于纤维的形成。从电泳图可以看出SPIG和SPIA的成分基本相同,但是SPIG没有形成纤维聚合物,二者的差异主要来自溶液中的离子强度,SPIA和SPIG两种原料pH2.0溶液的冻干粉的灰分分别为0.185%和0.119%,从图3中可以看出,SPIA的盐离子强度要大于SPIG的盐离子强度。Wang等研究发现增大离子强度可以加速纤维“构筑单位”的形成;Luben等[19]研究发现当离子强度大于13mol/L时,β-乳球蛋白才可以形成纤维,这些研究结果与本研究的结果都充分说明盐离子强度也是大豆蛋白纤维形成的一个必要条件。
3 结论
不同加工处理的大豆原料在低pH条件下,蛋白质的热聚合物形态存在很大差异。4种蛋白质形成纤维聚合物的能力不同,SPIA的最大荧光强度高出SPIG原料137.07%和TZ原料49.53%,SPIA的聚合速率分别是TZ的62倍和SPIG的41倍。这种差异与蛋白质组成有关,11S尤其是碱性亚基的存在可能一定程度上抑制纤维聚合物的形成。同时,在大豆蛋白组成相同的条件下,离子强度也是纤维形成的一个必要条件。
[1]Arnaudov L N,Vries D R,Ippel H,et al.Multiple steps during the formation of β-lactoglobulin fibrils[J]. Biomacromolecules,2003(4):1614-1622.
[2]Donald A M.Aggregation in β-lactoglobulin[J].Soft Matter,2008(4):1147-1150.
[3]Liu G,Ji L,Ke S,et al.Composition,secondary structure,and self-assembly of oat protein isolate[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry,2009,57(11):4552-4558.
[4]Zhang Y H,Tang C H,Wen Q B,et al.Thermal aggregationand gelation of kidney bean(Phaseolus vulgaris L.)protein isolate at pH2.0:Influence of ionic strength[J].Food Hydrocolloids,2010(24):266-274.
[5]Akkermans C,Van Der Goot A J,Venema P,et al.Micrometersized fibrillar protein aggregates from soy glycinin and soy protein isolate[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry,2007,55:9877-9882.
[6]Tang C H,Wang S S,Huang Q R.Improvement of heatinduced fibril assembly of soy β-conglycinin(7S Globulins)atpH2.0 through electrostatic screening[J].Food Research International,2012,46:229-236.
[7]Wang J M,Yang X Q,Yin S W,et al.Growth kinetics of amyloid-like fibrils derived from individual subunits of soy βconglycinin[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry,2011,59:11270-11277.
[8]Mark R H,Krebs.Amyloid fibril-like structure underlies the aggregate structure across the pH range for β-lactoglobulin[J]. Biophysical Journal,2009,96:5013-5019.
[9]LeVine H.Thioflavine T interaction with amyloid β-sheet structures[J].Amyloid,1995(2):1-6.
[10]Koscielska K K,Otlewski J.Amyloid-forming peptides selected proteolytically from phage display library[J].Protein Science,2003(12):1675-1685.
[11]Nilsson M R.Techniques to study amyloid fibril formation in vitro[J].Methods,2004,34:151-160.
[12]Misha R,Sorgjerd K,Nystrom S,et al.Lysozyme amyloidogenesis was accelerated by specific nicking and fragmentation but decelerated by intact protein binding and conversion[J].Journal of Molecular Biology,2007,366:1029-1044.
[13]Morris A M,Watzky M A,Agar J N,et al.Fitting neurological protein aggregation kinetic data via a 2-step,minimal/“Ockham’s razor”model:the Finke-Watzky mechanism of nucleation followed by autocatalytic surface growth[J].Biochemistry,2008,47(8):2413-2427.
[14]Loveday S M,Wang X L,Rao M A,et al.Tuning the properties of β-lactoglobulin nanofibrils with pH,NaCl and CaCl2[J].International Dairy Journal,2010,20:571-579.
[15]Hua Y F,Steve W,Cui Wang Q,et al.Heat induced gelling properties of soy protein isolates prepared from different defatted soybean flours[J].Food Research International,2005,38:377-385.
[16]Laemmli U K.Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4[J].Nature,1970,227:680-685.
[17]Utsumi S,Kinsella J E.Structure-function relationships in food proteins:Subunit interactions in heat-induced gelation of 7S,11Sand soy isolate proteins[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry,1985,33:297-303.
[18]汪立君,李里特,张晓峰.利用DSC对大豆蛋白质热变性的研究[J].中国农业大学学报,2001,6(6):93-96.
[19]Luben N,Arnaudov,Renko D V.Strong Impact of Ionic strength on the kinetics of fibrilar aggregation of bovine αlactoglobulin[J].Biomacromolecules,2006(7):3490-3498.
Comparison of fibril aggregates from different soy materials
DONG Shi-rong,XU Hong-hua*,GUO Shan-shan,GAO Yu-zhe,JU Ting-ting
(College of Food of Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China)
The aggregates of four kinds of soy protein from different production processes were formed with the different morphologies at low pH and heating at 90℃ for 10h.Thioflavin T(Th T)fluorescence,differential scanning calorimeter(DSC),and sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis(SDS-PAGE)were used to monitor the kinetics of aggregation and the protein compositions.The results indicated that protein compositions were remarkably different due to the different production processes.The glycinin(11S),especially basic subunits inhibited the formation of fibril aggregates under the test condition.In addition,ionic strength played an important role in the formation of fibril aggregates.
fibril;aggregate;soy protein;kinetics of aggregation
TS201.2
A
1002-0306(2014)04-0114-04
2013-07-08 *通讯联系人
董世荣(1988-),女,硕士研究生,研究方向:食品蛋白质。
国家自然基金项目(31071572);黑龙江省教育厅青年学术骨干项目(1155G10);黑龙江省高等学校科技创新团队建设计划项目(2010td11)。