罗非鱼鱼鳞肽钙复合物的稳定性研究

聂瑞艳，刘月娇，刘敏，刘尊英

（中国海洋大学食品科学与工程学院，山东青岛266003）

罗非鱼鱼鳞肽钙复合物的稳定性研究

聂瑞艳，刘月娇，刘敏，刘尊英*

（中国海洋大学食品科学与工程学院，山东青岛266003）

以罗非鱼鱼鳞为原料制备肽-钙复合物，以钙的结合量为指标，研究了体外胃肠道模拟消化、小肠刷状缘膜酶、共存食物成分、pH、热处理等因素对罗非鱼鱼鳞肽钙复合物稳定性的影响。结果表明，罗非鱼鱼鳞肽钙复合物对消化酶、小肠刷状缘膜酶的降解具有较高的耐受性，对NaCl、乳糖具有较好的稳定性（p＞0.05）；但对50℃以上的热处理较为敏感，钙结合量显著下降（p＜0.05）。鱼鳞肽钙复合物在pH2.0的酸性条件下易于解离，但在弱碱性条件比较稳定，pH9.0时钙结合率可达89.65%。推测肽钙复合物在小肠内主要以结合物的形式存在以阻止钙在碱性条件下的沉淀。

罗非鱼，鱼鳞，肽钙复合物，稳定性

鱼鳞是水产品加工中的主要副产物，占总量的5%左右。由于传统观念和技术的限制，我国鱼鳞等副产物因利用不当而造成浪费的现象日益突出[1]，每年废弃的鱼鳞多达30万t[2-3]。近年来随着鱼类产品加工量的逐年增加，由此产生的鱼鳞副产物也逐年升高，亟待利用解决。目前，关于鱼鳞的高值化利用研究，国内已有相关报道。杨立等[4]以草鱼鱼鳞为原料，采用碱性蛋白酶酶解的工艺制备了抗氧化活性的多肽。吴继魁等[5]等通过正交实验探讨了草鱼鱼鳞中卵磷脂的提取工艺，其研究结果为鱼鳞蛋白和脂肪的高值化利用提供了重要的参考数据。鱼鳞中蛋白（41%～55%）和钙盐（38%～46%）含量较高，而关于鱼鳞蛋白与钙的关系研究报道却很少。因此，本文以罗非鱼鱼鳞为原料制备鱼鳞肽钙复合物，探讨其在不同处理条件下的稳定性，以期为肽钙营养补充剂的开发提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

胰蛋白酶、风味酶 南宁庞博生物工程有限公司；胃蛋白酶 国药集团化学试剂有限公司；其他试剂 均为分析纯。

GL-21M型高速冷冻离心机 湘仪离心机仪器有限公司；FDU-1200型冷冻干燥机 上海爱朗仪器有限公司；UV-2550型紫外分光光度计 上海沪西分析仪器厂；DF-101S型集热式恒温加热磁力搅拌器 郑州长城科工贸有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 鱼鳞肽钙复合物的制备 罗非鱼鱼鳞肽钙复合物的制备参照文献[6-7]的方法进行。具体流程如下：罗非鱼鱼鳞→清洗、脱盐、烘干、粉碎→1∶10（w/v）加蒸馏水→调pH加酶酶解→灭酶→离心→上清液→加CaCl2→无水乙醇沉淀→离心去上清→沉淀冷冻干燥→鱼鳞肽钙复合物。

其中罗非鱼鱼鳞酶解采用胃蛋白酶、胰蛋白酶、风味蛋白酶分步酶解的方法，分别在其最适宜条件下进行，酶解条件如表1所示。

表1 罗非鱼鱼鳞蛋白的酶解条件Table.1 The hydrolysis conditions of the tilapia fish scale protein

1.2.2 鱼鳞及鱼鳞肽钙复合物成分测定 水分含量采用直接干燥法测定（GB 5009.3-2010）；蛋白质含量用微量凯氏定氮法测定（GB 5009.5-2010）；磷含量采用钼蓝比色法测定（GB 5537-85）；游离钙离子含量采用EDTA滴定法测定（GB/T 15452-2009）。

1.2.3 肽钙复合物钙结合量的测定 向待测样品加入终浓度为50%的无水乙醇，离心、分离，收集上清液，准确移取上清液定容至50mL，测定时取10mL样品，置于250mL三角烧瓶中，加入50mL蒸馏水、2mL 1∶1的三乙醇胺、2mL 20%NaOH、2mL 10%硫化钠，摇匀静置2～3min，加入0.1g盐酸羟胺，摇匀溶解，调pH至12.5，加少许钙红指示剂，立即用EDTA滴定至纯蓝色。同时用蒸馏水做空白。

上清液中游离钙含量（mg）=fc1（v1-v0）m

其中：c1为EDTA的浓度（mol/L）；v1为EDTA的滴定体积（mL）；v0为空白消耗EDTA的体积（mL）；m为钙的相对原子质量；f为稀释倍数。

肽钙复合物中钙结合量=样品中钙含量-上清液中游离钙含量。

1.2.4 肽钙复合物体外模拟胃肠道消化实验 体外模拟消化参照文献[8]的方法进行。将鱼鳞肽钙复合物配制成1%的溶液，用1mol/L HCl调pH2.0，加入1%（E/S）的胃蛋白酶在37℃条件下分别消化1、2h时取出样品，沸水浴灭酶5min，冷却至室温，胃蛋白酶消化结束后，用1mol/L NaOH将pH调至8.0，加入1%（E/S）胰蛋白酶在37℃条件下继续消化，分别于1、2h时取出样品，沸水浴灭酶5min，冷却至室温。将上述不同时期的样品加入无水乙醇沉淀，8000r/min离心10min，吸取上清，0.45μm微孔滤膜浓缩，于容量瓶定容至50mL，采用EDTA滴定上清液中游离钙含量。

1.2.5 肽钙复合物抗小肠刷状缘膜酶（BBMV）实验 抗小肠刷状缘膜酶实验参照文献[9]的方法进行。小肠刷状缘膜酶的制备参考文献[10]的方法，制得的悬浮液通过碱性磷酸酶（AKP）活性的测定及富集系数来确定是否可用，AKP酶活通过南京建材生物公司的碱性磷酸酶试剂盒测定。将鱼鳞肽钙复合物溶解在pH7.8的Tris-HCl缓冲液制成1%的溶液，加入10mL BBMV 37℃条件下分别于消化0.5、1、2、3、4h时取出样品，沸水中加热5min灭酶，冷却至室温，无水乙醇沉淀，测定上清液中游离钙含量。

1.2.6 共存食物成分的抗干扰实验 将鱼鳞肽钙复合物配制成1%（w/v）的溶液，分别添加0、0.2%、0.4%、0.8%、4%、8%的NaCl、乳糖，用无水乙醇沉淀的方法，EDTA滴定上清液中游离的钙含量。

1.2.7 酸碱稳定性实验 将鱼鳞肽钙复合物分别溶解在pH2.0的Clark-Lubs缓冲液、pH7.4的Tris-Hcl缓冲液、pH9.0的Clark-Lubs缓冲液中配成1%（w/v）的溶液，37℃下振摇2h后无水乙醇沉淀，测定上清液中游离钙含量。

1.2.8 热稳定性实验 将鱼鳞蛋白肽钙复合物配制成1%（w/v）的溶液，50、60、70、80℃水浴10、20、30min后取出样品，冷却至室温，测定上清液中游离钙含量。

1.3 数据处理

应用SPSS统计处理软件进行统计分析，实验设三次重复，采用Duncan’s新复极差法进行多重比较，检验其差异显著性。

2 结果与分析

2.1 鱼鳞肽及肽钙复合物基本成分分析

鱼鳞肽中，粗蛋白含量较高，钙含量较低（表2），而鱼鳞肽钙复合物中蛋白含量与钙含量均较高。鱼鳞肽钙复合物中的钙含量显著高于鱼鳞肽中的钙含量（p＜0.05），与葡萄糖酸钙中的钙含量（9%）相当，但低于乳酸钙（13%）、柠檬酸钙（21%）和碳酸钙（40%）中的钙含量。

表2 鱼鳞肽及肽钙复合物成分分析Table.2 The proximate analysis of fish scale hydrolysates and peptide-calcium complex

表3 胃蛋白酶、胰蛋白酶消化后肽钙复合物的钙结合量Table.3 The calcium binding activity of peptide-calcium complex after digestion by pepsin and trypsin

2.2 鱼鳞肽钙复合物抗消化实验结果

肽钙复合物稳定性受消化酶作用的影响结果见表3。随着胃蛋白酶作用时间的延长，钙结合量下降，肽的持钙能力降低，但胃蛋白酶作用1、2h时与不添加胃蛋白酶pH2.0的处理比较，三者之间无显著差异（p＞0.05）。表明肽钙复合物钙结合能力降低的原因可能与环境pH的改变相关，而受消化酶自身的影响较小。胃蛋白酶消化结束，改变环境的pH，钙结合量升高，胰蛋白酶作用1h与2h时，二者之间无显著性差异（p＞0.05）。体外模拟胃肠道消化实验表明，肽钙复合物经过胃蛋白酶、胰蛋白酶共同作用后，仍保留了消化酶作用前的68.16%的持钙能力，证明了肽钙复合物具有一定的抗消化性。

2.3 鱼鳞肽钙复合物抗小肠刷状缘膜酶（BBMV）实验结果

食物蛋白质被分解成小肽供人体吸收是在小肠上皮细胞的刷状缘膜上完成的，这层刷状缘膜覆盖着小肠的整个表面，含有大量的水解酶和转运系统，如肽链内切酶、羧肽酶、二肽酶、氨肽酶等[11-12]，而这些水解酶和转运系统又是蛋白质或肽被消化吸收时必不可少的工具。本实验中制备的小肠刷状缘膜匀浆液中AKP酶活为0.859U/g蛋白，BBMV中AKP酶活为12.1U/g蛋白，富集系数14倍。肽钙复合物的抗小肠刷状缘膜酶的结果见图1。鱼鳞肽钙复合物经BBMV消化水解2h后，肽钙复合物中钙结合量为74.8mg/g，保留了79.9%的活性。消化3h与4h的钙结合量相比，二者之间差异不显著（p＞0.05）。表明，鱼鳞肽钙复合物对小肠刷状缘膜酶有一定的耐受性。

2.4 共存食物成分NaCl、乳糖对鱼鳞肽钙复合物的稳定性研究

图1 BBMV处理对鱼鳞蛋白肽钙复合物钙结合量的影响Fig.1 Effect of BBMV on the calcium-binding activity of peptide-calcium complex

影响人体钙吸收的因素除了机体状态、肠道pH外，膳食因素也是影响人体钙吸收的一个重要条件。据Marie-Anne研究发现，碳水化合物在肠道中发生酵解，可以降低肠道pH，减少钙在碱性条件下沉淀，进而促进钙的吸收。摄入过多的食盐会增加尿钙的排出，抑制钙的吸收[13]。本实验通过添加不同浓度的乳糖、食盐考察了可能存在的食物成分在体外环境下对肽钙复合物稳定性的影响。图2结果表明，随着氯化钠浓度的提高，鱼鳞肽钙复合物中钙含量之间变化不明显（p＞0.05），图3中乳糖的添加也有类似结果（p＞0.05）。推测食物成分乳糖、氯化钠可能是通过改变肠道环境进而影响钙的吸收，而在体外环境下对肽钙复合物的影响不大。

2.5 鱼鳞蛋白肽钙复合物的酸碱稳定性研究

图2 NaCl对鱼鳞肽钙复合物钙结合量的影响Fig.2 Effect of NaCL on the calcium-binding activity of peptide-calcium complex

图3 乳糖对鱼鳞肽钙复合物钙结合量的影响Fig.3 Effect of lactose on the calcium-binding activity of peptide-calcium complex

肽钙复合物酸碱稳定性的实验结果如图4所示，肽钙复合物在酸性条件下易解离，pH2.0时肽钙复合物钙结合量（40.67mg/g）相比样品（93.6mg/g）显著性降低（p＜0.05）。这可能是因为酸性条件下H+与钙离子之间存在竞争，使钙离子结合量减少。在pH7.4的缓冲溶液中，钙的结合量为62mg/g，显著升高（p＜0.05）；在pH9.0的缓冲体系中，钙的结合量达到（89.65mg/g），与样品（93.6mg/g）相比无显著性差异。推测钙离子结合量的增加可能与pH的升高，H+浓度的减少，钙离子与NH3+和COOH-之间的作用增强有关。表明鱼鳞肽钙复合物在酸性条件下较易裂解，而在弱碱环境下可以保持一定的稳定性，抑制钙离子产生沉淀。

图4 pH对鱼鳞肽钙复合物钙结合量的影响Fig.4 Effect of pH on the calcium-binding activity of peptide-calcium complex

2.6 热稳定性研究

热处理是食品加工中常用的方式，为验证肽钙复合物的热稳定性，本研究考察了不同热处理温度和不同热处理时间对肽钙复合物稳定性的影响。结果表明，随着热处理温度的升高和热处理时间的延长，钙的结合量均呈现显著降低的趋势（p＜0.05）（图5）。80℃加热30min后，复合物钙的结合量降低到43.67mg/g，损失率达53.4%，其原因可能与热处理破坏蛋白质的空间结构，使蛋白质与钙离子结合能力下降有关。

图5 加热时间对鱼鳞肽钙钙结合量的影响Fig.5 Effect of heating time on the calcium-binding activity of peptide-calcium complex

3 结论

罗非鱼鱼鳞肽钙复合物对消化酶和小肠刷状缘膜酶具有一定的耐受性，对共存食物成分具有一定的稳定性，在酸性条件下复合物的钙结合量较低，在肠道的弱碱环境下钙的结合量提高。鱼鳞肽钙复合物阻止了钙在弱碱性条件下的沉淀，更有利于钙在吸收部位的稳定，是一种极具潜力的肽钙补充剂产品。

[1]朱国君.鱼鳞资源的综合开发利用[J].水产科技情报，2008，35（2）：95-95.

[2]段蕊，周银铃，张艳，等.滴定法监控鱼鳞脱钙过程的研究[J].淮海工学院学报，2004，13（2）：54-56.

[3]罗红宇.海鱼鱼鳞营养成分的分析[J].食品研究与开发，2003，24（3）：63-66.

[4]杨立，邹波.鱼鳞抗氧化肽的酶法制备工艺及特性[J].食品科学，2011，32（12）：115-119.

[5]吴继魁，张俊玲.草鱼鱼鳞中提取卵磷脂的最佳工艺[J].上海水产大学学报，2005，14（4）：429-431.

[6]Jung W K，Lee B J，Kim S K.Fishbonepeptide increases calcium solubility and bioavailability in ovariectomised rats[J]. British Journal of Nutrition，2006，95：124-128.

[7]慕现敏，黄海，刘尊英，等.脱钙处理对鱼鳞蛋白酶解效果及其持钙能力的影响[J].农产品加工，2012（8）：7-8.

[8]陈晨，迟玉杰，赵明阳，等.蛋清蛋白肽体外血管紧张素转化酶抑制活性及其消化稳定性[J].营养学报，2012，34（3）：274-277.

[9]ArivarasulN A，PriyamvadalS，Mahmood R.Oral administration of caffeic acid ameliorates the effect of cisplatin on brush border membrane enzymes and antioxidant system in rat intestine[J].Experimental and Toxicologic Pathology，2011，65：21-25.

[10]Prabhu R，Balasubramanian K A.A novel method of preparation of small intestinal brush border membrane vesicles by polyethylene glycol precipitation[J].Analytical Biochemistry，2001，289：157-161.

[11]Boutrou R. Glycosylations of K-casein-derived Gaseinomacropeptide reduce its accessibility to endo-but not exo-intestinal brush border membrane peptidases[J].Agric Food Chem，2008，56：8166-8173.

[12]Boutrou R，Coirre E.Phosphorylation and coordination bond of mineral inhibit the hydrolysis of the β-Casein（1-25）peptide by intestinal brush-border membrane enzymes[J].Agric Food Chem，2010，58：7955-7961.

[13]朱宣光，李德华，王国祥.临床药学[M].天津：天津科技出版社，1987.

Study on the stability of peptide-calcium complex from tilapia scale protein hydrolysates

NIE Rui-yan，LIU Yue-jiao，LIU Min，LIU Zun-ying*
（College of Food Science and Engineering，Ocean University of China，Qingdao 266003，China）

The stability of peptide-calcium complex from tilapia scale protein hydrolysates was investigated by in vitro simulated gastrointestinal digestion，the resistance of small intestinal brush border membrane，coexistence of food composition，pH，heat treatment and other factors.Results showed that the tilapia fish peptide-calcium complex had high tolerance to the degradation of digestive enzymes and the small intestinal brush border membrane，but was sensitive to heat treatment，and the calcium-binding activity was decreased significantly when the temperature up to 50℃（p＜0.05）.With NaCl and lactose treatment，peptide-calcium complex maintained a good stability and had a combining rate of 89.65%under pH9.0.The results suggested tilapia scale peptide and calcium mainly existed in the form of the peptide-calcium complex in the small intestine to prevent calcium precipitation under alkaline conditions.

tilapia；fish scale；peptide-calcium complex；stability

TS254.9

A

1002-0306（2014）04-0088-04

2013－06－13 *通讯联系人

聂瑞艳（1987-），女，硕士研究生，研究方向：水产品高值化利用。

国家自然科学基金资助项目（31101379）。