柱前在线衍生-高效液相色谱法测定保健食品纳豆胶囊中的牛磺酸

王宏华，刘菲，孙浩思

（北京燕京啤酒集团公司技术中心，啤酒酿造技术北京市重点实验室，北京101300）

柱前在线衍生-高效液相色谱法测定保健食品纳豆胶囊中的牛磺酸

王宏华，刘菲，孙浩思

（北京燕京啤酒集团公司技术中心，啤酒酿造技术北京市重点实验室，北京101300）

建立了检测保健食品中牛磺酸的柱前在线衍生-高效液相色谱方法。样品经过去离子水提取，与邻苯二甲醛在线衍生，以A相：0.02 mmol/L的乙酸钠（pH 7.2，0.018%三乙胺，0.3%的四氢呋喃）；B相：100 mmol/L的乙酸钠（pH 7.2）20%，乙腈40%，甲醇40%为流动相，梯度洗脱，采用Thermo Hypersil ODS C18色谱柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）分离，紫外线检测。方法检出限为0.51 mg/L；标准曲线的线性范围为0～1 000.0 mg/L，相关系数R2=0.999 2，具有良好的线性关系，加标回收率为103.9%～105.0%，相对标准偏差为0.9%～2.9%。该方法的灵敏度高、准确性好、前处理操作简单，适用于保健食品纳豆胶囊中牛磺酸含量的检测。

邻苯二甲醛；柱前在线衍生；高效液相色谱；牛磺酸；保健食品；纳豆胶囊

牛磺酸又称2-氨基乙磺酸，因1827年首次从牛胆汁分离出来而得名，长期以来对其的认知只停留在无功能的代谢产物。直到1975年HAYES K C等[1]发现因缺乏牛磺酸可使猫的视网膜老化甚至失明，牛磺酸的营养生理功能才得到国内外学者的重视并得以研究，此过程也逐步深入认识了其生物营养学价值。目前，美国、日本等发达国家有99%的牛磺酸用于食品添加剂，它们规定在婴幼儿食品中必须添加一定量的牛磺酸[2]。我国在这方面起步较晚，在1993年批准牛磺酸在乳制品、婴幼儿食品和谷物制品、强化饮料中使用。诸多研究表明，牛磺酸具有广泛的生理功能，是调节机体正常生理活动的重要活性物质，在实际生产和日常生活中具有广泛的应用价值[3]。

牛磺酸分子式为C2H6N2O3S，分子质量为125.15[4]。纯品为无色或白色斜状晶体，无臭，化学性质稳定，溶于乙醚等有机溶剂，是一种含硫的非蛋白氨基酸，在体内以游离状态存在，不参与体内蛋白的生物合成[5]。牛磺酸虽不参与体内蛋白质合成，但却与胱氨酸、半胱氨酸的代谢密切相关[6]，具有保护心血管系统、促进脂肪乳化、改善视功能和抗氧化等生理功能。人体主要通过摄取食物中的牛磺酸满足机体需要。牛磺酸几乎存在于所有生物之中，哺乳动物的主要脏器（如心、脑、肝脏）中含量较高，海产品中含量颇为丰富[7]。

目前测定食品中牛磺酸的方法主要有高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）荧光法[8]、薄层色谱法[9]、气相色谱法[10-11]、高效液相色谱法[12-14]、氨基酸自动分析法[7]、酸碱滴定法[4]等。酸碱滴定法简便易行，原理简单，但灵敏度及准确度均较低，且测定过程中干扰较多，个样的差别较大，无法满足牛磺酸含量较低的样品的测定。薄层色谱法灵敏度较低、属于半定量的方法，而且薄层厚度、薄层板的制备、点样技术以及展开的条件等难以保持恒定，从而影响定量的准确性。气相色谱法对样品的衍生化等方面要求较高。氨基酸自动分析法在分析的种类和数量等方面受到限制。由于高效液相色谱法较高的灵敏度、可靠性及相对较短的分析时间，使其成为测定牛磺酸最常使用的方法[15]。任一平等[12]应用邻苯二甲醛（O-phthalaldehyde，OPA）柱前衍生法测定食品中的牛磺酸，样品经预处理后，按比例加入定量的OPA衍生反应试剂，在碱性条件下与样液中的牛磺酸生成具有强荧光的物质，在开始衍生反应1 min后，立即终止反应，进样测定。孙洁[13]研究比较了氨基酸分析（amino acid analyzer，AAA）法与HPLC法，AAA法主要是样品经前处理，用去蛋白之后的样液经离子交换柱层析分离，被分离出的氨基酸通过柱后衍生与茚三酮溶液反应显色，用紫外检测器检测。丹磺酰氯柱前衍生HPLC测定牛磺酸，试样经水溶解提取，沉淀蛋白后取上清液用丹磺酰氯衍生化反应，室温避光衍生反应2 h，加入盐酸甲胺溶液终止反应，上清液进样测定。这两种方法的前处理过于复杂，不容易操作。本研究借鉴万玉萍等[14]的方法中的样品前处理，对测定条件进行了优化，样品应用OPA柱前在线衍生测定保健食品纳豆胶囊中的牛磺酸，方法简捷可靠，结果重复性良好。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

燕京中发牌改善记忆胶囊：北京燕京中发生物技术有限公司。

邻苯二甲醛（10 mg/mL）、硼酸缓冲液（0.4 mol/L，pH 10.2）：美国安捷伦公司；冰醋酸（纯度99.5%）、甲醇、乙腈（色谱级）、无水乙酸钠（分析纯）、三乙胺、四氢呋喃（色谱级）、牛磺酸（纯度≥99%）：美国Sigma公司；所有用水都采用Milli Q纯水。

1.2 仪器与设备

1100高效液相色谱仪（真空脱气器、四元泵、自动进样器、柱温箱、UV检测器）：美国安捷伦公司；B1210E-DTH超声水浴：美国赛默飞世尔公司。

1.3 试验方法

1.3.1 色谱条件

色谱柱：BDS HYPERSIL C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：A相：0.02 mmol/L乙酸钠加0.018%三乙胺混匀，用10%冰乙酸调pH值至7.2，加0.3%的四氢呋喃混匀，过0.45 μm滤膜过滤备用；B相：20%100 mmol/L乙酸钠，用10%冰乙酸调pH值至7.2，体积分数为40%乙腈、40%甲醇过0.45 μm滤膜过滤备用；程序洗脱梯度如表1所示；流速：1 mL/min；柱温：40℃；进样量：1 μL；检测波长：338 nm。

表1 样品梯度洗脱条件Table 1 Gradient elution conditions of samples

1.3.2 标样溶液配制

称取牛磺酸标样100.0 mg于50 mL容量瓶中，用去离子水溶解定容，配制成质量浓度为2 000.0 mg/L的贮备液，于4℃冷藏备用。工作标准溶液用去离子水把贮备液稀释成100.0 mg/L。

1.3.3 样品处理

称取样品（纳豆胶囊内部粉末）200.0 mg于100 mL容量瓶中，加入适量去离子水溶解样品，放置于143 W超声波水浴中室温提取10 min，用去离子水定容，折叠滤纸过滤，滤液用0.45 μm滤膜过滤后备用。

2 结果与分析

2.1 流动相与波长的选择

分别比较了使用10 mmol/L的乙酸钠缓冲液-乙腈= 70∶30及甲醇-乙腈-乙酸钠梯度洗脱，试验发现后者的分离效果更好。另比较不同的检测器波长（330 nm和338 nm），发现前者杂峰的响应要高于后者，因此选用338 nm为试验用波长。

2.2 衍生试剂用量的试验

本研究的纳豆胶囊[16]用于增强免疫力、改善记忆力，牛磺酸作为食品营养强化剂添加到纳豆胶囊中，一般添加量为10 g/100 g左右，而OPA衍生试剂的用量需通过试验确定。在任一平等[12]的研究中，20 μL样品加20 μL OPA衍生试剂，万玉萍等[14]的研究中以2.5 μL样品加2.5 μL OPA衍生试剂，样品与衍生试剂都是1∶1关系。考虑到原有检测啤酒中氨基酸方法是以1.0μL样品加1.0μLOPA衍生试剂，以防衍生不彻底，取三份1.0μL牛磺酸标样（1 000.0 mg/L），分别加入1.0 μL、2.0 μL、4.0 μL OPA衍生试剂作样品制备和分析，结果见表2。

表2 OPA衍生剂用量试验Table 2 OPA derivative dosage test

由表2可见，随着衍生试剂用量的增加，测得的色谱峰面积逐渐变小，可能是由于总体积增加而使得色谱峰面积值减少，但换算成相同总体积时，面积依然减少，说明衍生试剂用量在2.0 μL、4.0 μL时没有更多的衍生化牛磺酸产生，可确定衍生试剂1.0 μL时衍生完全。

2.3 衍生时间的试验

在所有查找的资料中，衍生反应时间各不相同，有反应1 min[12]、2 min[13]后进样。就此展开试验，在其他条件不改变的情况下，进样器程序中选择混合振荡后直接进样，和混合振荡后等待1 min、2 min进样，试验结果没有区别。因此，选择混合振荡后直接进样。

2.4 方法线性关系及检出限

将标准贮备液适当稀释，按上述色谱条件进样分析。以牛磺酸的响应峰面积（Y）对其质量浓度（X，mg/L）作标准曲线，结果见图1。

图1 牛磺酸标准曲线Fig.1 Standard curve of taurine

由图1可知，其线性范围为0～1 000.0 mg/L，线性方程为Y=2.189 2X+2.760 3，相关系数R2=0.999 2，牛磺酸的质量浓度与其峰面积具有较好的线性关系，并以3倍信噪比，得出方法检出限为0.51 mg/L。

2.5 方法精密度试验

取3种不同添加量胶囊样品，按照方法要求，分别测定其牛磺酸含量，在重复条件下获得的6次独立测定结果及均值和相对标准差，结果如表3所示。

表3 精密度试验测定结果Table 3 Results of precision experiment

由表3可知，相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）为0.9%～2.9%，＜5%，表明该方法有很好的精密度。

2.6 加标回收率试验

取一已知本底质量浓度的纳豆胶囊，分别添加50.0 mg/g、100.0 mg/g的牛磺酸，去离子水为提取剂，重复测定3次，结果见表4。牛磺酸标样、样品及样品加标的谱图见图2。

表4 回收率测定结果(n=3)Table 4 Determination results of recovery rate(n=3)

图2 牛磺酸标样、样品及样品加标的图谱Fig.2 Chromatogram of tanrine standard sample,sample and adding standard sample

由表4可知，平均加标回收率为103.9%～105.0%，表明方法准确度较好。

2.7 样品的检测与分析

分别对不同批次的成品胶囊进行牛磺酸含量测定，测定结果如表5所示。

表5 纳豆胶囊中牛磺酸含量Table 5 Taurine content in natto capsule

由表5可知，每粒胶囊0.4 g，含牛磺酸45 mg左右，每天2次，每次3粒，可以作为食品营养强化剂[17]使用，给人体提供270 mg相当含量的牛磺酸。

3 结论

采用HPLC柱前在线衍生方法可以准确测定保健食品纳豆胶囊中的牛磺酸，该法的相对标准偏差为0.9%～2.9%，回收率为103.9%～105.0%。另由于牛磺酸多为游离态存在，易于与其他作用于蛋白质合成的氨基酸相区别，因而本方法灵敏度高，专一性强，最低检出限为0.51 mg/L。可作为质量监督控制的有效方法，为其稳定高效的生产提供技术保障。

[1]HAYES K C,PRONCZUK A,ADDESA A E,et al.Taurine modulates platelet aggregation in cats and human[J].Am J Glin Nutr,1989,49(6): 1211-1232.

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Determination of taurine in health food natto capsules by HPLC with precolumn derivatization

WANG Honghua,LIU Fei,SUN Haosi
(Beijing Key Laboratory of Beer Brewing Technology,Technical Center of Beijing Yanjing Beer Group Corporation, Beijing 101300,China)

The determination method of taurine in health food was established by HPLC with precolumn derivatization.Samples were extracted with deionized water,online derived with o-phthalaldehyde derivation,using phase A:0.02 mmol/L sodium acetate(pH 7.2,0.018% triethylamine,0.3% tetrahydrofuran);phase B:100 mmol/L sodium acetate(pH 7.2)20%,acetonitrile 40%,methanol 40%as mobile phase to conduct gradient elution. Samples were separated by Thermo Hypersil ODS C18column(4.6 mm×150 mm,5 μm)and detected by ultraviolet light.The detection limit was 0.51 mg/L,the standard curves were linear in the range of 0-1 000.0 mg/L,the linear relation was good with correlation coefficient R2=0.999 2;the adding recovery rate was 103.9%-105%,and the relative standard deviation was 0.9%-2.9%.The method has the advantage of high sensitivity,good accuracy,easy to operate,and suitable for determination of taurine content in health food natto capsules.

O-phthalaldehyde;online precolumn derivatization;HPLC;taurine;health food;natto capsules

O657.7

A

0254-5071（2014）10-0136-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2014.10.033

2014-08-15

北京市燕京啤酒集团内部课题

王宏华（1973-），女，高级工程师，本科，研究方向为液相色谱技术在啤酒酿造过程中的应用。