液态菌种培养在芝麻香型白酒细菌麸曲中的应用

刘建波，薛德峰，曹建全，周利祥

（山东景芝酒业股份有限公司，山东安丘，262119）

液态菌种培养在芝麻香型白酒细菌麸曲中的应用

刘建波，薛德峰，曹建全，周利祥

（山东景芝酒业股份有限公司，山东安丘，262119）

芝麻香型白酒细菌麸曲的菌种一般采用固态帘子培养方式，培养方式粗放，染菌几率高；接种量为5%～10%，菌种培养工作量大。细菌液态法培养具有效率高，不易染菌等优势。研究合适的液态培养基和培养方法，用种子罐代替帘子后，大大降低了染菌几率，降低了劳动强度，提高生产效率，降低了生产成本。

芝麻香型白酒；细菌麸曲；液态菌种

芝麻香型白酒是建国后新创立的白酒香型，其生产工艺融合浓香、清香、酱香三大香型之长，被誉为香型融合的典范[1]。芝麻香型白酒以独特的工艺和优雅细腻、绵甜醇厚的风格深受消费者的喜爱[2]。芝麻香型白酒酿造用曲包括大曲和三类纯种麸曲，是中国代谢产物最为丰富的白酒香型之一。这也进一步证明了多微麸曲在提高白酒质量方面效果明显[3]。

美拉德反应对白酒香味影响较大[4]，尤其是吡嗪类香味物质对芝麻香型白酒风格形成至关重要[5]，嗜热芽孢杆菌能够产生酸性蛋白酶，代谢产生吡嗪类香味物质，能够大幅提高芝麻香型白酒复杂香味成分含量[6]。同时，芽孢杆菌能够促进2,3-丁二醇、双乙酰的生成[7]，提高白酒中乙酸乙酯的含量，降低乳酸乙酯的含量，使酒体更加协调自然[8]，是白酒产品质量的重要途径。

随着芝麻香型白酒研究的进展，细菌曲的研究应用得以迅速发展[9]。芝麻香型白酒细菌麸曲的菌种培养一般采用固态帘子培养方式[10]，培养方式较粗放，接种量为5%～10%，菌种培养工作量大，生产效率低。细菌液态法培养具有操作方便、劳动强度低、效率高、不易染菌等优势。通过培养条件进行试验优化[11-12]，研究合适的液态培养基和培养方法，用种子罐代替帘子，进行液态法菌种的培养试验，取得了较好的效果。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌种

公司生产用细菌6株，均为嗜热芽孢杆菌，主要包括地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌等。

1.1.2 培养基

培养基1：麸皮10%、水90%；

培养基2：麸皮9%、豆粕1%、水90%；

培养基3：麸皮5%、豆粕1%、玉米粉4%、氯化钠0.05%、水90%[13]；

培养基4：麸皮5%、豆粕1%、玉米粉2%、酵母粉2%、氯化钠0.05%、水90%。

实验采用所有试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

CJ-1S超净工作台：天津市泰斯特仪器有限公司；LDZX-75KB高压灭菌器：上海申安医疗器械厂；SPX-250BⅢ恒温培养箱：天津市泰斯特仪器有限公司；CX-41荧光显微镜：奥林巴斯有限公司；QTZ-FQ-20一级种子罐、QTZ-FQ-200二级种子罐、QTZ-FQ-1000三级种子罐：扬中市润泽生物工程设备厂；CM-13圆盘制曲机：宁波长荣酿造设备有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 培养工艺

细菌培养工艺流程及操作要点如下：

细菌菌种扩培流程：

菌种试管→一级三角瓶（121℃灭菌20 min，恒温摇床培养，37℃2 d）→二级三角瓶（121℃灭菌20 min，恒温摇床培养，37℃32 d）

一级种子罐扩大培养：培养基放入种子罐（培养基体积15 L），搅拌均匀，121℃灭菌30 min，接种三角瓶种子后培养。

二级种子罐扩大培养：培养基放入种子罐（培养基体积150 L），搅拌均匀，121℃灭菌30 min，接种三角瓶种子后培养。

三级种子罐扩大培养：培养基放入种子罐（培养基体积800 L），搅拌均匀，121℃灭菌30 min，接种三角瓶种子后培养。

1.3.2 培养条件选择

针对培养基、培养温度、供氧方式等进行试验[12]，选择最佳培养条件。

培养温度：35℃、40℃、45℃、55℃、60℃；供氧方式：不供氧、间歇供氧（供氧时间20%）、间歇供氧（供氧时间50%）、一直供氧；搅拌方式：不搅拌、间歇搅拌、一直搅拌。

1.3.3 液态与固态种子培养方式及通风制曲生产效率对比

将液态种子培养和固态种子培养进行生产效率的对比。将制作好的液体种子用于圆盘通风制曲生产（采用圆盘制曲机自动控制培养），将生长温度、菌数等参数与固体帘子菌种进行比较。

1.3.4 检验方法

总酸测定方法：GB/T 10345—2007《白酒分析方法》中指示剂法，总数以乙酸计。细菌计数方法：采用滤膜过滤处理后[14]，用荧光显微镜直接计细菌总数[15]。

2 结果与分析

2.1 培养基对细菌生长的影响

6株细菌混合培养，采用显微镜直接计细菌总数，测定培养液酸度。选择4种不同培养基分别培养，培养温度45℃，培养时间3 d，间歇供氧（供氧时间50%）。培养结果见图1。

从图1可以看出，适当调整培养基，改善培养基营养配比，能够较大幅度提高细菌总数。在相同的培养条件下，培养基4酸度低，细菌数高。

图1 不同培养基对细菌总数(A)及酸度(B)的影响Fig.1 Effect of different medium on total number of bacteria(A) and acidity(B)

2.2 培养温度对细菌生长的影响

根据高温细菌的生长需要，分别选择35～40℃、40～45℃、45～50℃、55～60℃4个温度段进行培养（培养基配比选择培养基4，其他条件同2.1），培养结果见图2。

图2 培养温度对细菌总数(A)及酸度(B)的影响Fig.2 Effect of culture temperature on total number of bacteria(A) and acidity(B)

从图2可以看出，由于所选菌种为嗜热芽孢杆菌，较高的培养温度有利于菌体生长，随着培养温度的升高，细菌总数明显增加。温度为55～60℃时，抑制了产酸杂菌的生长，曲料酸度偏低，菌体总数最高。

2.3 供氧方式对细菌生长的影响

选择不供氧、间歇供氧（供氧时间20%）、间歇供氧（供氧时间50%）、一直供氧四种方式，进行供氧和搅拌（供氧时启动搅拌）培养试验（培养温度选择55～60℃，其他条件同2.2），试验结果见图3。

图3 供氧方式对细菌总数(A)及酸度(B)的影响Fig.3 Effect of oxygen supply mode on total number of bacteria(A) and acidity(B)

从图3可以看出，不同的供氧方式对细菌生长的影响比较大。间歇供氧（50%）和一直供氧的培养方式效果相差不大，细菌对氧的需求一般。间歇供氧方式培养基酸度稍低于一直供氧方式。

2.4 不同菌种培养方式及对通风制曲效果的影响

表1 菌种培养方式对麸曲生产的影响Table 1 Effect of different culture methods on Fuqu production

采用液态种子制作方式，生产细菌麸曲种子，人均投料量（每批次投料量/工日）由固态培养方式的23 kg/工日，提高到220 kg/工日，生产效率为固态培养方式的9.6倍。应用于通风制曲生产后，通风制曲试验结果见表1。

从表1可以看出，固态种子制曲效果稍好，但和液态种子效果相差不大。

3 结论

通过对芝麻香型白酒细菌麸曲采用液态法培养研究，确定液态培养最佳条件为：培养基麸皮5%、豆粕1%、玉米粉2%、酵母粉2%、氯化钠0.05%、水90%；培养温度55～60℃；供氧方式间歇供氧（供氧时间50%），培养时间3 d。成熟液态菌种用于大生产，使用效果与固体菌种相差不大。生产效率大幅提升，人均投料量为固态培养方式的10倍。用液态种子罐培养方式代替传统固态帘子操作，生产环境大大改善，劳动强度大大降低，是传统酿酒行业现代化模式转变的必然。

[1]周利祥，赵德义，来安贵，等.景芝神酿酒生产工艺及风格特点[J].酿酒，2008，35（3）：27-29.

[2]王海平，来安贵，赵德义.芝麻香型白酒的发展[J].酿酒科技，2006（9）：104-107.

[3]随增树，陈明亮，孙建平.应用多维麸曲提高白酒质量的研究[J].中国酿造，1997，16（4）：27-28.

[4]庄名扬.再论美拉德反应与中国白酒的香和味[J].酿酒科技，2005（5）：34-38.

[5]庄名扬，杨涛.美拉德反应产物（Maillard Reaction Products，MRPs）的生理活性及增量的技术措施[J].酿酒，2009，36（3）：80-83.

[6]徐岩，吴群，范文来，等.中国白酒中四甲基吡嗪的微生物产生途径的发现与证实[J].酿酒科技，2011（7）：37-40.

[7]王月梅，赵迎路.芽孢杆菌对汾酒风味的影响[J].酿酒科技，2002（5）：31-32.

[8]刘桂君，刘红霞，胡建华，等.地衣芽孢杆菌在牛栏山二锅头基酒生产中的应用[J].酿酒科技，2009（8）：83-84.

[9]曹建全，刘建波，薛德峰.芝麻香型白酒细菌曲研制[J].酿酒，2010，37（6）：35-38.

[10]付立业，谌永前，周剑丽，等.细菌麸曲通风制曲生产要点[J].酿酒科技，2012（3）：52-53.

[11]高林峰，汤庆莉，吴天祥.麸曲制备工艺的优化研究[J].中国酿造，2010，29（11）：62-65.

[12]吴青录，秦秀丽.枯草芽孢杆菌液体培养条件的研究[J].吉林农业，2014，266（4）：65-66.

[13]袁超，崔乐芳，王瑞明.地衣芽孢杆菌在麸曲中产中性蛋白酶发酵工艺条件的研究[J].酿酒科技，2011（3）：40-41.

[14]刘戈青，吕维敏，刘魁武，等.基于滤膜上细菌直接计数法的细菌总数快速检测[J].生物医学工程研究，2009，28（1）：60-62.

[15]鲁巍，王云，张晓健.饮用水中几种细菌计数方法的比较[J].环境科学，2004，25（4）：167-169.

Application of liquid strain cultivation in the bacterial Fuqu of sesame flavor Chinese liquor

LIU Jianbo,XUE Defeng,CAO Jianquan,ZHOU Lixiang
(Shandong Jingzhi Liquor Co.,Ltd.,Anqiu 262119,China)

The ordinary cultivation way of the bacterial Fuqu of the sesame flavor Chinese liquor adopts the solid curtain,which is open and easy to be contaminated.The inoculum is 5%-10%and the cultivation workload is too much.Liquid strain cultivation possesses much advantage such as high efficiency and less contamination.By researching suitable liquid culture medium and culture method,and after replacing the curtain with seeds cans, the contamination,the labor intensity,and the production cost were greatly reduced.

sesame flavor liquor;bacterial Fuqu;liquid strain

TS261.1

A

0254-5071（2014）10-0127-03

10.11882/j.issn.0254-5071.2014.10.030

2014-08-17

刘建波（1977-），男，高级酿酒技师，本科，主要从事酿酒微生物的研究工作。