骆驼刺源产乳酸的地衣芽孢杆菌分离鉴定和菌株特性研究

应璐，周慧杰，蒋慧

（1.塔里木大学生命科学学院，新疆阿拉尔843300；2.塔里木生物资源保护与利用兵团重点实验室，新疆阿拉尔843300；3.塔里木大学动物科技学院，新疆阿拉尔843300；4.塔里木畜牧科技兵团重点实验室，新疆阿拉尔843300）

骆驼刺源产乳酸的地衣芽孢杆菌分离鉴定和菌株特性研究

应璐1，2，周慧杰1，蒋慧3，4*

（1.塔里木大学生命科学学院，新疆阿拉尔843300；2.塔里木生物资源保护与利用兵团重点实验室，新疆阿拉尔843300；3.塔里木大学动物科技学院，新疆阿拉尔843300；4.塔里木畜牧科技兵团重点实验室，新疆阿拉尔843300）

为了探讨产乳酸的芽孢杆菌对青贮发酵的作用。以青贮三个月的豆科牧草疏叶骆驼刺为材料，进行MRS培养基分离、纯化细菌，革兰氏染色，芽孢染色，细胞形态学观察，生理生化特性鉴定和16S rDNA序列分析。结果显示，菌株杆状，G+，有芽孢，产乳酸；16S rDNA测序结果显示该菌株与模式菌株ATCC 14580的相似性为99.3%。结果表明，该菌为地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）。关键词：地衣芽孢杆菌；分离鉴定；生理生化特性；16S rDNA

青贮是将原料中的可溶性糖转化成乳酸等酸性物质，创造出的酸性环境能够抑制有害微生物增殖，从而保存原料营养成分的过程[1]。青贮饲料是复杂的微生物系统，主要包括乳酸菌、酵母菌、梭菌、霉菌及其他腐败细菌，其中乳酸菌是青贮发酵中起主要作用的微生物[2]。骆驼刺（Alhagi sparsifolia）是生长于荒漠、半荒漠区的多年生豆科木质化草本植物，耐干旱、耐盐碱、抗逆性强[3]。豆科牧草可溶性碳水化合物含量低，附着乳酸菌数目少，蛋白质含量高，缓冲能力强，pH下降缓慢，从而导致大量繁殖的梭菌将蛋白质和糖分解为氨和腐臭味的丁酸，一般认为豆科牧草不容易成功青贮[4-6]。然而，研究结果表明，无添加的高水分骆驼刺青贮容易成功，且骆驼刺和苜蓿混贮还能显著提高苜蓿青贮品质[5]。近年来饲料中抗生素滥用被高度关注[8-9]，寻找安全高效的替代品迫在眉睫[10]。具有抗逆性强、耐高温高压、耐酸碱、耐胆盐、易贮存等生物特性的枯草芽孢杆菌[11]是美国食品药品监督管理局和中国农业部批准的饲用微生物[11]。新疆特殊的地理位置和地质地貌造就了其干旱、盐碱、极端高温、极端低温等多样的生态环境，与新疆自然环境相适应的微生物在漫长的演化过程中形成了具有独特的代谢途径和遗传背景的微生物类群[12]。长期的协同进化，微生物与其宿主形成了相互依赖、相互制约的统一整体[13]。

本研究旨在探讨新疆特殊环境G+芽孢杆菌与其宿主骆驼刺青贮成功的关系，对其进行分类学鉴定，确定种属，了解其生理生化特征，为合理开发利用骆驼刺资源提供基础数据资料。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 实验材料

初花期疏叶骆驼刺采集于塔里木大学校园周边，采后快速将其切割成2～3 cm，装入500 mL试剂瓶，每瓶约700 g，细木棒层层压实后用凡士林和透明胶带密封，采集、切割、压紧、填装和密封控制在3 h以内，青贮3个月备用。

1.1.2 培养基

①分离纯化培养基采用MRS固体培养基：蛋白胨10 g，酵母膏5 g，葡萄糖20 g，牛肉膏10 g，K2HPO42 g，柠檬酸二铵2 g，乙酸钠5 g，葡萄糖20 g，吐温-80 1 mL，MgSO4·7H2O 0.58 g，MnSO4·4H2O 0.25 g，琼脂18 g，蒸馏水1 000 mL，调pH 6.2～6.4，121℃灭菌30 min。MRS液体培养基不加琼脂。

②生理生化鉴定培养基：碳源同化基础培养基、氮源同化基础培养基参照《伯杰细菌鉴定手册》[14]和《常见细菌系统鉴定手册》[15]。

1.1.3 试剂

rTaq聚合酶、dNTP、DL2000等PCR试剂、PCR产物回收试剂盒（TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0）均为TaKaRa公司生产，其他试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

RXZ-300C智能人工气候培养箱：江苏宁波东南仪器有限公司；DHG-9140电热鼓风干燥箱：上海一恒科学仪器有限公司；FHZ-82A气浴恒温振荡器：金坛市医疗器械厂；FHZ-82A超净工作台：上海BoXun有限公司；FA-JA2004 N电子天平：上海精密科学仪器有限公司；LDZX-50KB立式压力蒸汽灭菌器：上海申安医疗器械厂；CX31生物显微镜：日本OLYMPUS；BCD-226SD冰箱：青岛海尔股份有限公司；732可见分光光度计：上海光谱仪器有限公司；DYY-6D电泳仪：北京六一仪器厂；MiniSpin Plus高速冷冻离心机、Research plus：德国Eppendorf公司；GelDoc 2000凝胶成像系统、iCycler PCR仪：美国BIO-RAD公司；细菌微量生化反应管：杭州天河微生物试剂有限公司。

1.3 方法

1.3.1 地衣芽孢杆菌的分离纯化

将切碎的样品用灭菌水做10倍梯度的稀释，充分振荡使其混匀，将混匀后的材料进行倍比稀释，选取10-5、10-6、10-7三个稀释度，菌悬液500 μL涂布于MRS培养基固体平板上，每个梯度稀释液涂布3个平板，37℃厌氧培养48 h，光学显微镜进行革兰氏染色观察和芽胞染色观察，阳性单菌落分离纯化后MRS液体培养基37℃厌氧培养24 h，25%灭菌甘油-18℃保存备用。

1.3.2 地衣芽孢杆菌16S rDNA序列分析

取1 mL活化菌悬液，12 000 r/min离心1 min，弃上清液，收集菌细胞作为PCR扩增模板，16S rDNA通用引物[16]，27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和1492R：5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′。PCR反应体系（25μL）：10×PCR Buffer（含Mg2+）2.5 μL，dNTP 2.5 mmol/L 2.0 μL上下游引物2.5 mmol/L各0.5 μL，rTaq（5 U/μL）酶0.3 μL，模板1 μL，重蒸水18.2 μL。PCR反应程序：95℃预变性5 min；95℃变性45 s，55℃退火45 s，72℃延伸90 s，30个循环；72℃后延伸10 min。16S rDNA扩增产物1%琼脂糖凝胶电泳检测，使用TaKaRa公司PCR回收试剂盒，按说明书回收、纯化目的片段。经纯度检测后，委托上海生工生物工程技术有限公司进行测序，测序结果在NCBI中的进行BLAST同源比对，初步鉴定细菌种类。使用DNA Star软件以Lipman Method分析此菌株与模式菌株16S rDNA的相似性。

1.3.3 地衣芽孢杆菌的生理生化特性鉴定

在地衣芽孢杆菌16S rDNA序列分析的基础上进行碳源同化实验、氮源同化实验方法参考《伯杰细菌鉴定手册》[14]和《常见细菌系统鉴定手册》[15]，产乳酸实验、明胶液化实验、淀粉水解实验、接触酶实验等采用细菌微量生化反应管鉴定，耐盐实验、耐酸实验、温度生长实验参照[17]。

2 结果与分析

2.1 菌落和细胞形态特征

从青贮3个月的疏叶骆驼刺中分离得到5株革兰氏阳性菌，分别命名为H1、H2、H3、H4和H5。菌体杆状，长1.5～3.0 μm，宽0.6～0.8 μm，内有明显芽孢，见图1；菌落不透明白色，表面平滑而干燥，边缘整齐。

图1 分离菌株显微照片(1 000×)Fig.1 Photomicrographs of isolated strain(1 000×)

2.2 16S rDNA序列分析

16S rDNA分析方法已经被用于芽孢杆菌的鉴定[18]，将分离纯化得到的菌株H1进行16S rDNA测序，序列全长1 516 bp，结果见图2。该序列与GenBank数据库中已收录序列进行BLAST比对，初步确定为地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）。采用DNAStar软件分析该序列与地衣芽孢杆菌的模式菌株ATCC 14580（NCBI登录号：NR_074923）16S rDNA基因序列相似性99.3%。

2.3 生理生化特征

根据16S rDNA序列分析结果对菌株H1进行了生理生化鉴定，结果见表1、表2。

图2 菌株H1 16S rDNA序列测序结果Fig.2 16S rDNA sequence of strain H1

由表1可知，菌株H1可以同化碳源α-D-葡萄糖、纤维二糖、D-蜜二糖、D-半乳糖、蔗糖、D-海藻糖、乳糖、果糖、D-棉子糖、甘露糖、D-甘露醇、D-木糖、丙三醇、山梨醇和麦芽糖，不能同化碳源龙胆二糖、L-山梨糖、L-鼠李糖、D-松三糖、木糖醇和松二糖；可以同化氮源（NH4）2SO4和KNO3。

表1 碳源、氮源同化实验结果Table 1 Results of carbon and nitrogen assimilation tests

由表2可知，菌株H1能够产乳酸、液化明胶、水解淀粉和接触酶阳性；15～55℃均能生长，65℃停止生长；弱酸性到中性条件下（pH 4～7）均能生长，强酸性条件下（pH≤3）停止生长；2%～10%NaCl正常生长，12%NaCl停止生长。

表2 菌株生理生化实验结果Table 2 Results of strain physiological and biochemical tests

3 结论

骆驼刺青贮中分离得到一株革兰氏阳性芽孢杆菌，经菌落形态特征鉴定、生理生化特征鉴定及16S rDNA序列分析，鉴定为地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）。

[1]张慧杰，玉柱，王林，等.孙启忠青贮饲料中乳酸菌的分离鉴定及优良菌株筛选[J].草地学报，2011，19（1）：137-141.

[2]张秀芬.饲草饲料加工与贮藏[M].北京：中国农业出版社，2004.

[3]曾凡江，张希明，李小明.骆驼刺植被及其资源保护与开发的意义[J].干旱区地理，2002，25（3）：286-288.

[4]张金霞，乔红霞，刘雨田.水分和添加剂对紫花苜蓿青贮品质的影响[J].草业科学，2014，31（4）：766-770.

[5]许庆方.影响苜蓿青贮品质的主要因素及苜蓿青贮在奶牛日粮中应用效果的研究[D].北京：中国农业大学博士论文，2005.

[6]刘春龙，李忠秋，孙海霞，等.影响青贮饲料品质的因素[J].中国牛业科学，2006，32（5）：63-66.

[7]JIANG H,JIANG Q S,YING L.Effect of different maturity on Alhagi sparsifolia Shap silage quality[C].International Conference on Computer Distributed Control and Intelligent Environmental Monitoring(CDCIEM),Changsha,China,2011.

[8]程锦泉，刘少础.超级细菌的警示与滥用抗生素潜在公共卫生问题[J].中国公共卫生，2010，26（12）：1521-1522.

[9]冯晶晶，王小万，靖瑞锋.控制抗生素滥用的国际经验及启示[J].中国抗生素杂志，2014，39（1）：14-18.

[10]李燕荣，兰邹然，姜平.新型抗生素替代品研究进展[J].当代畜牧，2014（3）：54-56.

[11]赵述淼.猪源益生芽孢杆菌的分离筛选与应用研究[D].武汉：华中农业大学博士论文，2009.

[12]唐永红，曹庸，卢成瑛，等.特殊生境微生物及其活性代谢产物研究进展[J].微生物学报，2006，33（4）：163-166.

[13]JENSEN M S,JENSEN S K,JAKOBSEN K.Development of digestive enzymes in pigs with emphasison lipolytic activity in the stomach and pancreas[J].J Anim Sci,1997,75(2):437-445.

[14]布坎南R.E，吉本斯N.E.伯杰细菌鉴定手册[M].第8版.北京：科学出版社，1984.

[15]东秀珠，蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册[M].北京：科学出版社，2001.

[16]TOJU H,TANABE A S,YAMAMOTO S,et al.High-coverage ITSprimers for the DNA-based identification of ascomycetes and basidiomycetes in environmental sample[J].PloS One,2012,7(7):1-11.

[17]范志平，王修俊，程艳波，等.泡菜中优良乳酸菌的筛选鉴定及生长特性的研究[J].中国调味品，2014，39（3）：10-14，26.

[18]朱薇玲，张苹，李金华.芽孢杆菌B15的分子生物学鉴定及高产蛋白酶菌株选育[J].中国酿造，2013，32（7）：65-67，93.

Isolation,identification and characterization of Bacillus licheniformis from Alhagi sparsifolia Shap.

YING Lu1,2,ZHOU Huijie1,JIANG Hui3,4*
(1.College of Life Science,Tarim University,Alaer 843300,China;2.Xinjiang Production&Construction Corps Key Laboratory of Protection and Utilization of Biological Resources in Tarim Basin,Tarim University,Alaer 843300,China;3.College of Animal Science,Tarim University,Alaer 832003,China;4.Xinjiang Production&Construction Corps Key Laboratory of Animal Husbandry Science and Technology in Tarim,Alaer 843300,China)

In order to explore the effect of lactic acid-producing Bacillus on silage fermentation,using Alhagi sparsifolia Shap.ensiled for three months as materials,Bacillus was isolated and purified with MRS medium.And then the isolate strains were identified with Gram staining,spore staining,cell colony morphology observation,physiological and biochemical characteristics identification and 16S rDNA sequencing analysis were used to identify.Result showed that the bacterium were rod-shaped,Gram-positive,spore-forming,and lactic acid-producing.The 16S rDNA result showed that the similarity between the strain and the published sequence(type strain ATCC 14580)was 99.3%.To sum up,the strain was identified as Bacillus licheniformis.

Bacillus licheniformis;identification;physiological and biochemical characteristics;16S rDNA

Q93-331

A

0254-5071（2014）10-0014-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2014.10.004

2014-07-04

国家自然科学基金（30960259，31260562）；大学生创新项目（20131075003）

应璐（1978-），女，讲师，硕士，研究方向微生物生物化学。

*通讯作者：蒋慧（1969-），女，教授，硕士，研究方向动物营养及饲料。