Box-Behnken法优化玉米秸秆预处理工艺对酶解糖化的影响

张莎莎，费兆奎，薛冬桦

（长春工业大学化学与生命科学学院，吉林长春130012）

Box-Behnken法优化玉米秸秆预处理工艺对酶解糖化的影响

张莎莎，费兆奎，薛冬桦*

（长春工业大学化学与生命科学学院，吉林长春130012）

为促进生物炼制产业发展，提高玉米秸秆酶解糖化效率，运用Box-Behnken试验设计优化预处理工艺，研究硫酸质量分数、反应时间、反应温度和固液比四个因素对半纤维素水解率的影响规律，并结合扫描电子显微镜、红外光谱仪、X-射线衍射仪分析玉米秸秆微观形貌、结构等指标。结果表明：玉米秸秆预处理最佳工艺为反应温度100℃、硫酸质量分数1.2%、反应时间120 min、固液比1∶9（g∶mL），在此条件下半纤维素水解率为84.93%，木质素脱除率为46.15%，预处理水解液还原糖质量浓度为2.04 g/100 mL，木糖产率为74.22%，87.89%纤维素保留在固体部分，经72 h酶解反应酶解率达到85.79%，未处理玉米秸秆酶解率仅为32.25%。

玉米秸秆；酸催化；酶水解

生物炼制工业过程是利用可再生的有机物质（包括农作物、植物、畜禽粪便、有机废弃物），通过工业加工转化，进行生物基产品、生物燃料和生物能源的生产[1]。玉米秸秆是潜在的生物资源，利用生物发酵技术将其转化为可发酵糖类，是当前解决资源、能源及环境等问题的有效途径。但玉米秸秆天然的抗降解结构阻碍纤维素降解为可发酵性糖类[2-4]，寻找高效的木质纤维素预处理方法，提高玉米秸秆酶解糖化效率，是解决这一问题的关键[5-7]。

美国国家可再生能源实验室系统开展了玉米秸秆替代粮食生产燃料乙醇的研究[8]，丹麦瑞索国家实验室系统研究玉米秸秆湿氧化预处理技术对玉米秸秆降解屏障影响[9]。北京非粮醇电联产技术研发中心开展了玉米秸秆蒸汽爆破预处理研究[10]，中国农业大学开展了促进玉米秸秆预处理效果的研究[11-12]，均表明预处理过程可提高玉米秸秆利用率。

开展以玉米秸秆为原料，运用Box-Behnken法H2SO4催化水热预处理玉米秸的研究，考察不同预处理条件下，玉米秸秆纤维素保留率，半纤维素水解率，木质素的去除率以及预处理后固体部分的酶解效率。探讨经预处理的玉米秸秆底物成分变化和结构变化，以及对可降解性能影响。揭示经预处理的玉米秸秆在化学键，结晶度，微观形貌和比表面积的变化，为玉米秸秆生物质资源的有效利用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验原料

玉米秸秆由长春大成集团实业有限公司提供，酶制剂来自诺维信公司。玉米秸秆原料组分经近红外分析：纤维素含量38.99%，半纤维素含量22.62%，木质素含量14.47%，水分含量5.04%。将玉米秸秆筛，取0.2～0.4 mm的秸秆备用。

1.2 仪器与设备

DF-101S集热式搅拌器：金坛市科技仪器有限公司；UV-5100紫外可见分光光度计：上海元析仪器有限公司；NIRFlex N-400近红外光谱仪：瑞士BUCHI公司；JSM-5500LV扫描电子显微镜：日本电子光学公司；Spectrum One傅立叶红外光谱仪：美国PE公司；D/MAX 2000PC X-射线衍射仪：日本理学有限公司。

1.3 方法

1.3.1 单因素试验

采用集热式搅拌器预处理玉米秸秆，其升温速率约为2～3℃/min，在不同的预处理条件下稀硫酸处理玉米秸秆，处理时间为系统到达目标温度后的保温时间。反应结束后，液体组分进行还原糖分析，固体部分干燥，酶解备用。

1.3.2 中心组合设计试验

在单因素试验基础上，选取硫酸质量分数、反应时间、反应温度、反应固液比作为Box-Behnken设计的自变量，半纤维素水解率为响应值，采用4因素3水平的响应面分析方法优化玉米秸秆预处理条件，进行中心组合优化试验。因素水平设计见表1。

表1 Box-Behnken试验因素水平编码Table 1 Factors and coded levels of Box-Behnken design

1.3.3 物料分析

利用傅里叶变换近红外漫反射光谱（near infrared reflectance spectroscopy，NIRS）技术和化学计量学软件，结合偏最小二乘法（partial least squares，PLS），通过光谱采集，进行近红外光谱模型预测及验证，建立玉米秸秆全组分分析模型[13]。应用近红外光谱仪对玉米秸秆预处理前后物料中纤维素、半纤维素、木质素含量分析。还原糖含量采用DNS（3,5-二硝基水杨酸）法测定[14]，木糖含量采用间苯三酚法测定[15]。

玉米秸秆原料半纤维素含量为22.62%，经预处理半纤维素全部转化为木糖，由方程计算木糖的理论产量25.70 g/100 g玉米秸秆[16]。

1.3.4 扫描电镜分析

将预处理前后玉米秸秆经过筛、干燥、表面镀金处理，固定在操作台，放大500倍进行形貌扫描分析。

1.3.5 红外光谱分析

傅立叶红外光谱仪检测预处理前后玉米秸秆。试验条件：采用固体KBr干粉压片，扫描范围4 000～4 500 cm-1，扫描32次。

1.3.6 X射线衍射分析

X射线衍射仪对物料进行分析，扫描范围10～40°，扫描速度为4°/min，步进扫描，步宽0.02°/s。采用衍射曲线拟合分峰计算法，表征纤维素的结晶度变化。

结晶度的计算公式[17]：

式中：CrI为结晶度；I002为结晶区的衍射角强度；Iam为无定形区的衍射角强度。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 硫酸质量分数对玉米秸秆预处理影响

图1 硫酸质量分数对玉米秸秆预处理影响Fig.1 Effect of sulfuric acid concentration on corn stover pretreatment

分别以质量分数为0.5%～1.5%的硫酸处理玉米秸秆，固液比1∶12.5（g∶mL），反应温度150℃，水解时间60 min。试验结果（图1）表明，硫酸质量分数＜1.0%，预处理过程不完全，半纤维素水解率降低，硫酸质量分数＞1.5%，玉米秸秆原料被碳化，造成物料损失。当硫酸质量分数为1.0%时，固体部分纤维素保留率为82.79%，半纤维素水解率为45.41%，木质素的脱除率为54.13%，还原糖质量浓度为1.63 g/100 mL，木糖产率为39.96%，此时半纤维素部分降解。木质素的去除，解除了对纤维素的束缚作用，有利玉米秸秆后续酶水解。

2.1.2 反应时间对玉米秸秆预处理结果影响

以质量分数为1.0%的硫酸于不同时间处理玉米秸秆，固液比1∶12.5（g∶mL），反应温度150℃。试验结果（图2）表明，反应时间为90 min时，还原糖质量浓度为最大值。随着反应时间的延长，秸秆发生碳化，部分还原糖缩合成多糖，生成部分糠醛、羟甲基糠醛等副产物。反应时间90 min预处理玉米秸秆，其纤维素保留率为61.18%，半纤维素水解率为32.87%，木质素的脱除率为40.09%，还原糖质量浓度为2.64 g/100 mL，木糖产率为44.39%。

图2 反应时间对玉米秸秆预处理影响Fig.2 Effect of reaction time on corn stover pretreatment

2.1.3 反应温度对玉米秸秆预处理影响

图3 反应温度对玉米秸秆预处理影响Fig.3 Effect of reaction temperature on corn stover pretreatment

用质量分数为1.0%硫酸于不同温度分别处理玉米秸秆90 min，固液比1∶12.5（g∶mL）。试验结果（图3）表明，随着温度升高，半纤维素水解率和纤维素保留率呈升高趋势，在120℃达到最大值。继续升高温度，半纤维素水解率、纤维素保留率均有所下降。反应温度120℃时，纤维素保留率为66.06%，半纤维素水解率为63.17%，木质素的脱除率为48.29%，还原糖质量浓度为1.70 g/100 mL，木糖产率为55.59%。

2.1.4 固液比对玉米秸秆预处理影响

于质量分数为1.0%的硫酸、温度120℃、反应时间90 min条件下，探讨不同固液比1∶16～1∶8（g∶mL）对玉米秸秆预处理影响（见图4）。玉米秸秆预处理过程是在非均相体系中进行，当玉米秸秆固体比例较高时，秸秆物料颗粒与硫酸催化剂混溶时会发生溶胀及结块，抑制催化剂对秸秆物料颗粒内部的渗透，导致预处理过程不完全。若液体比例增加，水解液中还原糖质量浓度降低。反应体系中固液比为1∶10（g∶mL）时，纤维素保留率为78.74%，半纤维素水解率为82.39%，木质素的脱除率39.49%，还原糖质量浓度为2.81 g/100 mL，木糖产率为72.48%。

图4 固液比对玉米秸秆预处理的影响Fig.4 Effect of solid-liquid ratio on corn stover pretreatment

2.2 响应面优化试验

2.2.1 响应面设计试验和显著性分析

综合单因素试验结果，应用Box-Behnken试验设计，硫酸质量分数（A）、反应温度（B）、反应时间（C）、固液比（D）作为响应面设计的因素，半纤维素水解得率为响应值，设计响应面试验，结果见表2。

利用Design-Expert软件对试验结果进行方差分析，结果见表3。通过对数据进行多元回归拟合，得到的拟合全变量二次回归方程模型为：Y=83.08+3.52A-1.54B+1.28C+ 0.81D-0.90AB-1.46AC-0.85AD-1.48BC-0.30BD+0.011CD-4.95A2-1.23B2-2.31C2-0.7D2用该回归方程描述各因素与响应值之间的关系时，其因变量和全体自变量之间的线性关系显著（R2=98.44%），模型的显著水平P＜0.01，此时二次回归方差模型是极显著的，方程对试验拟合较好，因此可用此模型对响应面进行分析和预测。通过比较方程一次项系数绝对值大小，可以判断在本试验工艺参数中，一次项均达到极显著水平，交互项除BD、CD外均显著，二次项显著。

表2 Box-Behnken试验设计方案及结果Table 2 Box-Behnken experimental design and results

表3 回归模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

2.2.2 响应面交互作用分析

利用Design-Expert软件进行二次多元拟合得到二次回归方程的响应面曲线，在两因素条件固定不变的情况下，考察各因素交互作用对玉米秸秆半纤维素水解率的影响，所得响应面如图5所示。

图5 各因素两两交互作用对半纤维素水解率影响的响应面和等高线Fig.5 Response surface plot and counter line of effect of interaction between each two factors on hydrolysis rate of hemicelluloses

由图5可知，各两因素对玉米秸秆半纤维素水解率的影响均成抛物线形，即随着硫酸质量分数、反应温度、反应时间、固液比的同时增大，玉米秸秆半纤维素水解率呈先增大后降低趋势，因此预处理工艺中在一定范围内适当增加各因素值可以提高半纤维素水解率。

2.2.3 响应面因素水平优化结果及模型验证

对回归模型进行响应面分析，得到半纤维素水解率预测最大值时各因素水平为硫酸质量分数1.16%，固液比1∶9（g∶mL），反应温度100℃，反应时间119.91 min，预测半纤维素水解率为85.11%。为进一步验证模型的可靠性，考虑到实际操作情况，将最佳工艺条件修正为硫酸质量分数1.2%，固液比1∶9（g∶mL），反应温度100℃，反应时间120 min。在此条件下进行3次平行试验，玉米秸秆固体部分纤维素保留率为87.89%，木质素脱除率为46.15%，还原糖质量浓度为2.04 g/100 mL，木糖产率为74.22%，玉米秸秆半纤维素水解率为84.93%，与理论预测值85.11%的偏差较小，表明Box-Behnken设计所得到的模型拟合程度高，优化结果可靠。

2.3 预处理后固体部分酶水解效率分析

为验证玉米秸秆预处理的效果，对玉米秸秆处理后所得滤渣进行酶水解研究。酶用量25 FPU/g，酶解温度50℃，反应时间72 h，试验结果（表4）表明，玉米秸秆原料酶解率为32.25%，预处理玉米秸秆固体部分酶解率为85.79%，与未处理秸秆相比酶解率提高53.54个百分点。

表4 玉米秸秆固体部分酶水解结果Table 4 Results of enzymatic hydrolysis of corn stover solid part

2.4 玉米秸秆预处理前后微观形貌分析

未处理的玉米秸秆在电镜下其纤维呈束状且结构致密，层与层之间呈现有序规律的排列（图6a），经预处理的玉米秸秆纤维呈现断裂层剥离现象，结构变得疏松，比表面积增大（图6b），预处理过程破坏了玉米秸秆内部结构，降低纤维素的结晶度，增加酶与底物的接触面积，有利于提高玉米秸秆的水解效率。

2.5 玉米秸秆预处理前后红外谱图分析

在木质纤维素的红外光谱中，纤维素的特征峰为2 920 cm-1、1 425 cm-1和1 374 cm-1，β-D-葡萄糖苷的特征峰为897 cm-1的吸收峰，半纤维素的特征峰为1 736 cm-1处的吸收峰，木质素的特征峰为1 510 cm-1和1 600 cm-1处的芳环振动吸收，1 045 cm-1、1 248 cm-1及1 270 cm-1代表C-H，O-H或-CH2键的伸展振动[17-18]。玉米秸秆预处理后β-D-葡萄糖苷的特征峰强度减小，1 045 cm-1处的吸收来自C-H弯曲振动，没有明显变化，1 605 cm-1和1 515 cm-1处的吸收峰是与木质素相关吸收峰，两峰相对吸收强度有变化（图7），提示经预处理的玉米秸秆物料内部结构发生变化。

图6 玉米秸秆预处理前(a)和预处理后(b)扫描电镜图Fig.6 Corn stover scanning electron micrograph before(a)and after(b)pretreatment

图7 玉米秸秆预处理前(a)和预处理后(b)红外谱图Fig.7 Infrared spectrum of corn stover before(a)and after(b)pretreatment

2.6 玉米秸秆X射线衍射分析

图8 玉米秸秆X射线衍射图Fig.8 X-ray diffraction diagram of corn stover

木质纤维素构成的结晶区占纤维素整体的百分数，为纤维素聚集时形成的结晶度。由图8可见，在22.0°、18.0°和16.0°各有一个主要峰和两个次要峰，这3个衍射峰均发生变化。经计算，预处理前玉米秸秆的结晶度为62.3%，预处理后玉米秸秆结晶度为49.6%，表明预处理后玉米秸秆中由于木质素部分去除，半纤维素大部分降解，纤维素中部分结晶区变为无定形区，可提高后续纤维素酶的可及性，增加酶解效率。

3 结论

本研究采用Box-Behnken试验设计方案优化玉米秸秆预处理工艺，提高糖化酶解效率，在此条件下获得的最佳工艺参数为硫酸质量分数1.2%，固液比1∶9（g∶mL），反应温度100℃，时间120 min，半纤维素水解率为84.93%，木质素脱除率为46.15%，还原糖质量浓度为2.04 g/100 mL，木糖产率为74.22%，固体部分纤维素保留率87.89%，结合方差分析，建立了硫酸质量分数、温度、时间、固液比和半纤维素水解率之间的数学模型方程为Y=83.08+3.52A-1.54B+ 1.28C+0.81D-0.90AB-1.46AC-0.85AD-1.48BC-0.30BD+ 0.011CD-4.95A2-1.23B2-2.31C2-0.7D2。模型回归检验F= 63.24，在0.01水平上差异极显著，表明Box-Behnken试验设计优化玉米秸秆预处理工艺结果是可靠的，预处理固体部分酶解率85.79%，比未处理玉米秸秆酶解效率提高了53.54%，此模型的建立可为生物炼制工业过程提供科学依据。

SEM，FT-IR和XRD分析表明，预处理过程破坏了玉米秸秆内部结构，降低纤维素的结晶度，增加酶与底物的接触面积，同时玉米秸秆中由于木质素部分去除，半纤维素大部分降解，纤维素中部分结晶区变为无定形区，因而可提高后续纤维素酶的可及性，增加酶解效率。

生物质资源比有限的石油能源更均匀地分布在地球的表面，我国为玉米主产区，玉米秸秆资源丰富，玉米秸秆通过预处理技术和生物转化过程，为生产生物基液体燃料、平台化学品、精细化工产品提供一条不依赖化石资源的新途径和新方法，为工业应用提供创新技术。

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Effect of corn stover pretreatment optimized by Box-Behnken design on enzyme sacchrification

ZHANG Shasha,FEI Zhaokui,XUE Donghua*
(College of Chemistry and Life Science,Changchun University of Technology,Changchun 130012,China)

To promote the development of bio-refinery industry and improve the efficiency of corn straw enzyme saccharification,Box-Behnken Design was applied to optimize the pretreatment process.The effect of sulphuric acid concentration,hydrolysis time,hydrolysis temperature and solid to liquid ratio on hemicellulose hydrolysis rate was optimized,and the microstructure,construction of the pretreated corn stover were analyzed by scanning electron microscope,infrared spectrometer and X-ray diffraction.Data showed that the optimal technology was determined:temperature 100℃, sulfuric acid 1.2%,time 120 min,solid-liquid ratio 1∶9(g∶ml).Under such condition,the hemicellulose hydrolysis rate was 84.93%,the lignin removal rate was 46.15%,reducing sugar content in pretreated hydrolysate was 2.04 g/100 ml,xylose yield was 74.22%,and cellulose retention in the solid was 87.89%.After 72 h enzymatic treatment,the hydrolysis rate reached 85.79%,while the untreated corn stover hydrolysis rate was 32.25%.

corn stover;H2SO4-catalyzed;enzymatic hydrolysis

TQ352.62

A

0254-5071（2014）10-0022-06

10.11882/j.issn.0254-5071.2014.10.006

2014-06-25

吉林省科技发展计划（20126035）；长春市科技支撑计划（2012213）

张莎莎（1987-），女，硕士研究生，研究方向为生物有机化学。

*通讯作者：薛冬桦（1956-），女，教授，博士，研究方向为生物有机化学。