宁夏产区酿酒葡萄酵母菌初步分类鉴定及多样性研究

张春芝，莫寅斌

（宁夏防沙治沙职业技术学院，宁夏银川750199）

宁夏产区酿酒葡萄酵母菌初步分类鉴定及多样性研究

张春芝，莫寅斌

（宁夏防沙治沙职业技术学院，宁夏银川750199）

通过对从宁夏产区的葡萄园土壤、葡萄果实表皮以及葡萄酒发酵过程中获得的729株野生酵母菌株进行初步分离、形态学鉴定，并运用显微镜摄像技术和利用WL营养琼脂培养基对酵母菌进行聚类分析，最终确定为16个酵母类型。进而确定宁夏产区的葡萄酒相关酵母菌的生物多样性，为地方特色葡萄酒酵母菌的筛选和选育提供理论基础和研究依据。

葡萄酒；酵母菌；分类鉴定；多样性

宁夏贺兰山东麓地区已经成为国际国内公认的最适宜种植优质酿酒葡萄的“黄金地带”，在全国酿酒葡萄产业中具有非常重要的地位[1]。葡萄酒酿造是一个复杂的微生物学过程，其中酵母菌是最重要的微生物菌群。酵母性能的好坏对葡萄酒产量、质量、经济性、生产管理均有较大影响，还对葡萄酒产品特色和风格的形成至关重要[2-3]。酿造具有地域特色的葡萄酒将成为关注的焦点，本土菌种的选育与发酵生产或者与其他菌种混合进行发酵，生产具有地区特色的葡萄酒成为葡萄酒产业发展趋势[4-7]。

在传统产区，酵母菌由于逐渐适应了当地的气候条件、土壤和葡萄品种，以及自然选择的作用，形成了适合当地葡萄酒的特有的天然优良酵母菌株，具有很强的地域特性，有助于酿酒师酿造出风味复杂而又有品种典型性的独特的葡萄酒[8-14]。通过显微镜摄像技术和利用WL营养琼脂培养基对宁夏产区的729株野生酵母菌株进行初步分类、鉴定和聚类分析，旨在确定宁夏产区的葡萄酒相关酵母菌的生物多样性，为筛选和选育具有地方特色葡萄酒酵母菌提供理论基础和研究依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 实验材料

2013年9月，分别从宁夏产区的青铜峡、玉泉营、大武口、西夏区四个地区的葡萄园中采集土壤样本和成熟度好的酿酒葡萄果粒，运抵实验室后，立即分离酵母菌。

1.1.2 培养基

酵母菌的分离和保存采用酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YEPD）培养基：葡萄糖2%，蛋白胨2%，酵母浸粉1%，琼脂2%，pH自然，121℃灭菌20 min（为除去细菌干扰，加100 mg/L氯霉素）。

初步形态分类采用WL营养琼脂培养基：酵母浸粉0.5%，胰蛋白胨0.5%，葡萄糖5%，琼脂2%，磷酸二氢钾0.055%，氯化钾0.042 5%，氯化钙0.012 5%，氯化铁0.000 25%，硫酸镁0.012 5%，硫酸锰0.000 25%，溴甲酚绿0.002 2%，pH值为6.0～6.5，121℃灭菌20 min。

1.2 仪器与设备

XTL-340Z正置金相显微镜：上海立光精密仪器有限公司；DRP-9082电热恒温培养箱：上海森信试验仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 菌株分离

土样中酵母菌株的分离：准确称取10 g土样（多点采样，然后混合）于100 mL 0.1%的蛋白胨水中（提前灭菌），充分振荡混匀，然后进行梯度稀释，选取合适的稀释度涂平板，于28℃培养3 d后结合菌落颜色和形态选取10～15个菌落保藏。

葡萄浆果表面酵母菌株的分离：在葡萄成熟季，无菌称量约10 g成熟葡萄，加入装有90 mL无菌水的三角瓶中，振荡培养30 min，制成菌悬液，准确吸取50 μL涂布于固体YEPD培养基上，28℃培养24 h，挑取单菌落再划线纯化的方法从中分离纯的酵母菌株。

发酵过程中酵母菌株的分离：在葡萄成熟季，采集葡萄浆果手工破碎后，取葡萄汁（带部分皮渣）置于200 mL三角瓶中，进行自然发酵。分别于发酵前期（即玻璃瓶底部产生少量气泡）、中期（发酵旺盛，产生大量气泡，皮渣在顶部形成“帽”）、后期（即液面降低，发酵醪液中无明显气泡上升）取样，采用稀释涂布，挑取单菌落再划线纯化的方法从中分离纯的酵母菌株。

1.3.2 菌种的保藏

将纯化的菌株在YEPD液体培养基中培养1 d，活化的菌液与30%的无菌甘油以体积比为1∶1混合于1.5 mL离心管中，-20℃条件下保藏。

1.3.3 菌株的WL营养琼脂培养基聚类分析

将保藏的酵母菌株用液体YEPD培养基活化后，划线接种于WL培养基上，28℃培养5～7 d后照相，观察记录菌落的颜色和形态，并根据菌落的颜色和形态进行聚类。

1.3.4 显微镜照相观察

选取有代表性的菌株接种于YEPD液体培养基中活化，在28℃下培养2 d，在显微镜下观察其个体形态特征。

2 结果与分析

2.1 宁夏产区酿酒酵母菌在WL培养基上的菌落特征、个体显微特征及形态分类结果

在宁夏葡萄酒产区分别从土壤、果皮、自然发酵过程分离得到729株野生酵母菌株，其在WL培养基上培养5 d所形成的菌落颜色和形态以及在显微镜下的个体特征见图1，对照《酵母菌特征与鉴定手册》[3]，初步分类鉴定为16个酵母菌类型，见表1。

图1 宁夏产区酿酒酵母菌在WL培养基上的菌落特征以及个体显微特征Fig.1 Wine-related Yeast colony characteristics on WL Nutrient Medium and microscopic characteristics from ningxia regions

表1 宁夏产区酿酒酵母菌在WL培养基上的形态分类结果[15,16]Table 1 Wine-related yeast morphological classification on WL nutrient medium from Ningxia region

2.2 不同地区酿酒葡萄园土壤和果实表皮上的酵母菌种类

不同地区酿酒葡萄园土壤中的酵母菌种类及分布情况见图2。由图2可知，青铜峡、大武口、西夏区三地的葡萄园土壤中共分离到酵母菌38株，青铜峡、大武口两地酵母菌数量较多，类型丰富，均能分离到五种类型，分别是是假丝酵母（Candida species）、葡萄酒有孢汉生酵母（Hanseniaspora vineae）、葡萄汁有孢汉逊酵母（Hanseniaspora uvarum）、戴尔有孢圆酵母（Torulaspora delbrueckii）以及没有提及的类型Ⅱ、类型Ⅴ；而西夏区仅分离到葡萄汁有孢汉逊酵母（Hanseniaspora uvarum）和类型Ⅴ。

图2 不同地区酿酒葡萄园土壤中的酵母菌种类及分布情况Fig.2 Species and distribution of yeast isolated from soil sample of different vineyards

图3 不同地区酿酒葡萄果实表皮的酵母菌种类及分布情况Fig.3 Species and distribution of yeast isolated from grape skin of different regions

由图3可知，青铜峡、大武口、西夏区三地酿酒葡萄果实表皮共分离得到酵母菌106株，主要是萄汁有孢汉逊酵母（Hanseniaspora uvarum）、全美梅氏酵母（Metschnikowia pulcherrima）、葡萄酒有孢汉生酵母（Hanseniaspora vineae）、红酵母（Rhodutorula）以及没有提及的类型Ⅱ、类型Ⅴ。大隐球酵母（Cryptococcus magnus）仅在大武口的葡萄表皮上分离出来。从总体数量看，大武口地区的酵母菌类型最为丰富，青铜峡次之，西夏区类型最少；可能与西夏区葡萄园建园时间短，葡萄树龄小以及土壤呈砂石结构有关。

2.3 不同酿酒葡萄品种果实表皮上的酵母菌种类

图4 不同酿酒葡萄品种果实表皮的酵母菌种类及分布情况Fig.4 Species and distribution of yeast isolated from grape skin of different varieties

由图4可知，5个不同酿酒葡萄品种的果实表皮酵母菌在类型和数量均存在较大差异。在分离得到酵母菌106株中，主要是萄汁有孢汉逊酵母（Hanseniaspora uvarum）、全美梅氏酵母（Metschnikowia pulcherrima）、葡萄酒有孢汉生酵母（Hanseniaspora vineae）、红酵母（Rhodutorula）以及没有提及的类型Ⅱ、类型Ⅴ。从品种上看，赤霞珠果实表皮酵母菌数量最多，其次是西拉，再者是霞多丽和蛇龙珠，数量最少的是黑比诺，只有全美梅氏酵母（Metschnikowia pulcherrima）一种。而东方伊萨酵母（Issatchenkia orientali）仅在霞多丽上发现。

2.4 酿酒葡萄自然发酵过程中的酵母菌种类

图5 青铜峡地区酿酒葡萄自然发酵过程分离的酵母菌种类及分布情况Fig.5 Species and distribution of yeast isolated from natural fermentation in Qingtongxia area

由图5可知，赤霞珠在自然发酵过程中，发酵前期的酵母菌主要由葡萄酒有孢汉生酵母（Hanseniaspora vineae）、葡萄汁有孢汉逊酵母（Hanseniaspora uvarum）、戴尔有孢圆酵母（T orulaspora delbrueckii）、红酵母（Rhodutorula）以及未提及的类型V构成，而且以类型V酵母菌为优势菌种。发酵中期又新增克鲁维毕赤氏酵母（Pichia kluyveri）、酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和大隐球酵母（Cryptococcus magnus）三种，而且以酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和类型V酵母菌在发酵中期和发酵后期成为主要的菌种。西拉在自然发酵过程中，发酵前期则以葡萄汁有孢汉逊酵母（Hanseniaspora uvarum）、戴尔有孢圆酵母（Torulaspora delbrueckii）和类型V酵母菌构成，中期新增葡萄酒有孢汉生酵母（Hanseniaspora vineae）、假丝酵母（Candida species）、酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和大隐球酵母（Cryptococcus magnus）四种酵母菌，而且葡萄酒有孢汉生酵母（Hanseniaspora vineae）、酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）为主要优势菌种，发酵后期仅剩下酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）。

图6 大武口地区酿酒葡萄自然发酵过程分离的酵母菌种类及分布情况Fig.6 Species and distribution of yeast isolated from natural fermentation in Dawukou area

由图6可知，赤霞珠在自然发酵过程中，发酵前期的酵母菌主要由葡萄酒有孢汉生酵母（Hanseniaspora vineae）、葡萄汁有孢汉逊酵母（Hanseniaspora uvarum）、红酵母（Rhodutorula）以及未提及的类型V、类型Ⅱ构成，而且以葡萄汁有孢汉逊酵母（Hanseniaspora uvarum）和类型Ⅱ酵母菌为优势菌种。发酵中期则以葡萄汁有孢汉逊酵母（Hanseniaspora uvarum）和酿酒酵母（Saccharomyces cere visiae）为主。发酵后期仅剩下酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae）。西拉在自然发酵过程中，发酵前期则主要以葡萄酒有孢汉生酵母（Hanseniaspora vineae）、葡萄汁有孢汉逊酵母（Hanseniaspora uvarum）和大隐球酵母（Cryptococcus magnus）为主，中期则以酿酒酵母（Saccharomyces cerevisi ae）和未提及的类型V为主。后期仅剩下酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）。蛇龙珠在自然发酵过程中，发酵前期则主要以葡萄酒有孢汉生酵母（Hanseniaspora vineae）和葡萄汁有孢汉逊酵母（Hanseniaspora uvarum）为主，中期则新增粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）、酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）等菌种，而且以未提及的类型V为主体菌种。后期也只剩下酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）。

图7 玉泉营地区酿酒葡萄自然发酵过程分离的酵母菌种类及分布情况Fig.7 Species and distribution of yeast isolated from natural fermentation in Yuquanying area

由图7可知，赤霞珠在自然发酵过程中，发酵前期的酵母菌主要有未提及的类型V和类型Ⅱ为主要菌种；发酵中期则以葡萄汁有孢汉逊酵母（Hanseniaspora uvarum）和酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）为主；后期以酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和未提及的类型V和类型Ⅱ为主要菌种。蛇龙珠在自然发酵过程中，发酵前期则以假丝酵母（Candida species）、葡萄汁有孢汉逊酵母（Hanseniaspora uvarum）和类型V酵母菌为主，中期、后期分别以葡萄汁有孢汉逊酵母（Hanseniaspora uvarum）、酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）为主。品丽珠自然发酵过程中，酵母菌分布规律与蛇龙珠非常相似。

由图8可知，赤霞珠在自然发酵过程中，发酵前期以葡萄酒有孢汉生酵母（Hanseniaspora vineae）、全美梅氏酵母（Metschnikowia pulcherrima）和类型V为主；发酵中期则以葡萄汁有孢汉逊酵母（Hanseniaspora uvarum）和类型V为主；后期则以酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）为主。黑比诺在自然发酵过程中，发酵前期只有葡萄酒有孢汉生酵母（Hanseniaspora vineae）、葡萄汁有孢汉逊酵母（Hanseniaspora uvarum）和全美梅氏酵母（Metschnikowia pulcherrima）三种酵母菌；中期则以葡萄汁有孢汉逊酵母（Hanseniaspora uvarum）和类型Ⅱ为主；后期则以葡萄汁有孢汉逊酵母（Hanseniaspora uvarum）和酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）为主。霞多丽在自然发酵过程中，前期以葡萄酒有孢汉生酵母（Hanseniaspora vineae）和全美梅氏酵母（Metschnikowia pulcherrima）为主要菌种；中期则以葡萄酒有孢汉生酵母（Hanseniaspora vineae）和红酵母（Rhodutorula）为主；后期以酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和类型V为主。

图8 西夏地区酿酒葡萄自然发酵过程分离的酵母菌种类及分布情况Fig.8 Species and distribution of yeast isolated from natural fermentation in Xixia area

3 结论

对从宁夏产区分离得到的729株葡萄酒相关酵母，经WL培养基进行聚类分析，最终确定为16种类型（其中类型V和类型Ⅱ无法经过形态学确认酵母菌种属），进而确定了宁夏产区葡萄酒酵母菌群具有多样性。

土壤和葡萄果实表皮上的酵母菌类型和数量因采集地点不同存在较大的差异，这与葡萄园土壤类型、土壤结构、葡萄树龄、品种等因素有关，即与葡萄园长期形成的微生物群体生态密切相关。酿酒葡萄品种成为酵母菌差异显著化的主要因素。

在葡萄果皮和自然发酵前期未分离到酿酒酵母菌，可知在葡萄果皮上不存在酿酒酵母菌。在不同葡萄品种的自然发酵过程中，均呈现出发酵前期酵母菌类型约3～4种，数量较少，而且非酵母菌属的酵母菌类型V和类型Ⅱ酵母菌参与启动了发酵；发酵中期其类型很丰富，一般会新增3～4种类型；发酵后期多数以酿酒酵母为主要菌种，而且属于能够适应耐酒精能力更强及在高糖环境中更具竞争力的酵母菌属酿酒酵母菌。

西夏区的各品种自然发酵前期均分离得到全美梅氏酵母（Metschnikowia pulcherrima），在中、后期则分离不到该菌种。

今后开展本土化酿酒酵母菌群研究的方向，可以重点对葡萄酒发酵后期分离得到的酿酒酵母（Saccharomyccs cerevisiac）菌株进一步改良，并对其酿酒性能和酿成的葡萄酒产品质量进行深入研究，从而选育具有地区特色的葡萄酒酿酒酵母，更好地服务于葡萄酒产业。

了解产区酿酒酵母来源以及葡萄浆果发酵过程中各酵母的动态变化对葡萄酒的酿造具有重要的意义。本研究已经为生产具有贺兰山东麓地域特色的葡萄酒而分离筛选本土化酵母菌进行了初步探索和实践。这对宁夏产区葡萄酒发酵工艺的控制以及优良酵母的筛选和优化具有一定的意义，也为该地区酵母资源的开发利用奠定了基础。

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Classification,identification and diversity of wine-related yeast from Ningxia regions

ZHANG Chunzhi,MO Yinbin
(Ningxia Institute of Prevention and Control of Desertification,Yinchuan 750199,China)

In this study,729 wild yeast strains from soil,grape skins and wine fermentation process in Ningxia regions were isolated and identified. Microscope camera technique and WL nutrient medium was used to conduct clustering analysis on these strains.After morphological observations, these strains were determined as 16 yeast types.Then the diversity of wine-related yeast in Ningxia regions was determined,to provide theoretical basis and research foundation of screening and ascertain Ningxia characteristic wine yeast.

wine;yeast;classification and identification;diversity

TS261.1

A

0254-5071（2014）10-0049-06

10.11882/j.issn.0254-5071.2014.10.012

2014-07-16

宁夏高校科研项目（NGY2012146）

张春芝（1977-），女，讲师，本科，研究方向为食品微生物。