脑星形细胞瘤基质金属蛋白酶2、9(MMPs-2,MMPs-9)的表达与瘤周水肿相关性的研究

湖北省宜昌市第二人民医院放射科(湖北 宜昌 443000)

李齐勇 梁社富 林国成曹劲松 毛建平

星形细胞瘤是以星型胶质细胞形成的肿瘤，约占颅内肿瘤的40%左右[1]。目前临床上该疾病的检查诊断方法以CT(computed tomography)和MRI(magnetic resollance imaging)为主。而MRI对测量肿瘤体积及肿瘤周边水肿体积有比较明确的优势。现代肿瘤学研究表明，基质金属蛋白酶(Matrix Metalloproteinases，MMPs)在肿瘤血管生成与侵袭中发挥重要作用，其表达与脑胶质瘤侵袭微生态系统中血瘤屏障的改造重建以及基因多态性等有关；已有报道，大鼠脑胶质瘤模型中，基质金属蛋白酶的表达与CT以及MRI图像上所显示的瘤周水肿范围密切相关[2-3]，但是，在人脑星形细胞瘤中，MMPs-2以及MMPs-9的表达量与瘤周水肿的相关性研究甚少报道[4-5]，基于此，我们通过手术和病理证实的病例-对照分析，结合本院实际情况，采用免疫组织化学法，对68例脑星形细胞瘤中基质金属蛋白酶2、9的表达水平与瘤周水肿范围两者之间的相关性进行了探讨与分析，以期为该肿瘤的临床诊断以及合理的治疗方案制定提供一定的研究依据。

1 材料与方法

1.1 研究对象收集2011年10月～2013年11月期间我院经手术病理证实的脑星形细胞瘤68例，在手术前一周都经过MRI检查，病人手术前未经过放疗及化疗等其它治疗方法。其中Ⅰ级共14例，Ⅱ级25例，Ⅲ级19例，Ⅳ级10例(按照WHO分级，1999年)。其中男性共39例，女性29例，患者年龄范围为8～75岁，平均年龄为38岁。

1.2 材料与试剂MMPs-2、MMPs-9试剂盒购自北京中山公司，免疫组化所用鼠抗人单克隆MMPs-9抗体，鼠抗人单克隆MMPs-2抗体，鼠抗人单克隆CD34抗体均购自福建迈新生物技术有限公司。

1.3 免疫组化方法及基质金属蛋白酶表达水平的判定方法[6-7]对所有病例的HE染色及免疫组织化学切片(所有病例均做免疫组化，然后请相关的病理学专家阅片检查与分析)。免疫组化操作方法按照试剂盒说明书步骤进行，用磷酸缓冲液(PBS)代替一抗作为本研究中的阴性对照。

MMPs-2、MMPs-9结果判断：阳性结果主要表现为显微镜下肿瘤细胞胞质、血管内皮、间质中出现棕黄色团块或颗粒。随机选取5个高倍镜视野计每个视野200个细胞中阳性细胞数，计算阳性百分率，然后取其平均值，阳性细胞数小于10%者为“-”；阳性细胞数10～55%者为“+”；阳性细胞数大于55%者为“++”。胞质内无棕黄色颗粒或者团块的细胞为MMPs-2、MMPs-9阴性细胞。

1.4 磁共振检查及MRI图像分析方法所有病例均进行MRI检查。仪器：1.5T Toshiba VISART 4.04 MR机及GE Signa 1.5T MR机，5英寸和3英寸表面线圈，扫描条件：MR机和GE Signa 1.5T MR机，3英寸及5英寸表面线圈，扫描条件：SE T，WI：TR450 HIS，TEl5 ms，NEX 2，FSE T2WI：TR4200ms，TEl00ms，层厚2.5mm，矩阵256×256，扫描野7.0×7.0cm；其后行增强扫描，条件同平扫T。

图像分析：首先，对比增强T1WI、T2WI两种时期肿瘤的生长情况，其次，选取肿瘤最大层面，利用它计算平扫、增强T1WI肿瘤的信号大小，用百分率来表示肿瘤强化程度，肿瘤强化程度定义为平扫和增强T1WI肿瘤的信号强度差值与平扫T1WI肿瘤信号强度值的比值；最后，于增强T1WI处，测量3个值：肿瘤最大直径Dmax、垂直的径线长度L、冠状位(矢状位)的最大高度H，瘤体体积计算公式=Dmax×L×H/2，同样的，在T2WI计算包括水肿在内的总体积，水肿体积=总体积－瘤体体积，水肿指数(EI)计算公式=水肿体积/瘤体体积。

1.5 数据统计与处理方法采用SPSS 19.0统计学应用软件对数据进行整理与分析，所有的计量资料采用均数±标准差(+S)来表示，各组间参数比较采用t检验，相关分析采用Spearman法，p＜0.05表示差异有统计学意义，p＜0.01表明差异有显著性的统计学意义。

表1 MMPs-2的表达与肿瘤病理分级的关系

表2 MMPs-9的表达与肿瘤病理分级的关系

表3 脑星形细胞瘤各病理分级的水肿指数

表4 脑星形细胞瘤肿瘤体积、水肿指数与肿瘤细胞中MMPs-2的表达结果

表5 脑星形细胞瘤水肿程度与肿瘤细胞中MMPs-9的表达量相关分析

图1 各病理期肿瘤体积、水肿指数与MMPs-2表达量柱形图

图2 各病理期肿瘤体积、水肿指数与MMPs-9表达量柱形图

图3,4,7 肿瘤病理分级较低的脑星形细胞瘤病例MRI图像及免疫组化染色图，其中图3为T1WI为强化，图4为T2WI Flair,瘤周小片状水肿，图7基质金属蛋白酶棕黄色染色，数量较少；图5,6,8 肿瘤病理分级较高的脑星形细胞瘤病例MRI图像及免疫组化染色图，其中图5为T1WI强化，图6为T2WI Flair，瘤周水肿很明显，图8基质金属蛋白酶棕黄色染色，数量多，呈条状。图9 脑星形细胞瘤免疫组化MMPs-2染色示例(×400)图10 脑星形细胞瘤免疫组化MMPs-9染色示例(×400)

2 结 果

2.1 免疫组化结果正常脑组织中，MMPs-2阳性染色定位于血管基底膜以及血管内皮细胞胞浆，其他部位未见到阳性染色；在脑星形细胞瘤中，不仅在内皮细胞浆和血管基底膜可见到MMPs-2的阳性表达，而且在肿瘤细胞胞浆内MMPs-2亦呈阳性表达，并多数聚集在肿瘤侵袭边缘的血管周围；在正常脑组织中并未有MMPs-9的阳性染色，而在脑星形细胞瘤中，MMPs-9阳性染色主要出现在肿瘤侵袭边缘的瘤细胞和血管基底膜及内皮细胞胞浆。MMPs-2、MMPs-9阳性染色区域基本上是一致的。

2.2 MMPs-2的表达与脑星形细胞瘤病理分级的关系(表1)从数据趋势上可以看出，随着肿瘤恶性程度的提升，基质金属蛋白酶2的表达量亦随之增大，MMPs-2在该肿瘤的表达水平与疾病的严重程度呈现正向关系，另外，Ⅲ～Ⅳ级肿瘤中MMPs-2的表达量明显高于Ⅰ～Ⅱ级，两者比较，差异具有统计学意义(t=7.872,p＜0.05)。实验结论对于脑星形细胞瘤的预判与治疗具有积极意义。

2.3 MMPs-9的表达与脑星形细胞瘤病理分级的关系(表2)随着脑星形细胞肿瘤恶性程度的上升，MMPs-9的表达量也表现出逐步上升的趋势，Ⅲ～Ⅳ级肿瘤中MMPs-9的表达量明显高于Ⅰ～Ⅱ级，两者比较，差异具有统计学意义(t=5.076,p＜0.05)，这对于该肿瘤发生及发展程度的预判有比较重要的参考作用。

2.4 MRI结果68例脑星形细胞瘤病例，MRI能较为清晰的显示肿瘤生长的基本特征，包括肿瘤的大小和形态变化，显示胶质瘤位于右侧尾状核，呈浸润性生长，无包膜，平扫时T1WI呈稍低信号，T2WI呈稍高信号。随着肿瘤恶性程度的增加(从Ⅰ级到Ⅳ级)，MRI图像上显示，肿瘤实质强化效应逐步增大，周边脑组织水肿信号也随之增强(图3-6)。肿瘤强化程度、水肿指数、肿瘤体积等参数与肿瘤病分级的关系(表3)。

病理Ⅰ级组与病理Ⅱ级组之间水肿指数的差异不具有统计学意义(p＞0.05)；病理Ⅰ级组与其它两组(病理Ⅲ级组和病理Ⅳ级组)之间EI的差异均具有统计学意义(p＜0.05)；病理Ⅲ级组与病理Ⅳ级组之间水肿指数的差异也具有统计学意义(p＜0.05)。这说明各病理期脑星形细胞瘤的水肿指数具有一定的正向相关性。

2.5 MMPs-2的表达与瘤周水肿的相关性分析基质金属蛋白酶2的表达量与MRI图像分析所得参数EI的相关性分析采用Spearman法，结果见表4及图1所示。

2.6 MMPs-9的表达与瘤周水肿的相关性分析基质金属蛋白酶9的表达量与MRI图像分析所得参数EI的相关性分析采用Spearman法，结果见表5及图2所示。

3 讨 论

肿瘤的生长可以分为两个阶段：第一阶段为无血管的缓慢生长期，可以在人体内持续数年；第二阶段为血管期，此期肿瘤组织因为有了新生血管，从而持续不断的为其提供营养和排除代谢废物而迅速增长[2]。新生血管形成包括毛细血管内皮层下基底膜降解、内皮细胞迁移和增殖等一系列过程，肿瘤细胞和内皮细胞的迁移和侵袭均需蛋白溶解酶对细胞外基质与基底膜进行降解[2]，而MMPs-2和MMPs-9是基质金属蛋白酶家族中的Ⅳ型和Ⅴ型胶原酶，它们恰好能有效降解细胞外基质和基底膜[8]，现代研究表明，基质金属蛋白酶在肿瘤的发生与侵袭中发挥重要作用[9]。基于此，本研究通过病例-实例分析的方法证实了脑星形细胞瘤中瘤周水肿恶劣程度与肿瘤细胞中MMPs-2和MMPs-9的表达呈现正相关的关系，从而为该肿瘤的预判和治疗方案的合理选择提供了一定的科学依据。

3.1 MRI图像前期有较多的研究表明，MRI图像上显示的瘤周水肿情况与MMPs-9的表达有关[10-15]。因此，本研究借鉴此成果，采用磁共振成像观察和判断脑星形细胞瘤生长状况以及瘤周水肿的情况，据此分析基质金属蛋白酶表达与瘤周水肿的相关性。具体来讲，肿瘤周围脑组织水肿的范围与程度、中线结构位移大小可由MRI中T2WI图像标识，而TlWI的增强图像，强化瘤体与周边未有强化的脑组织水肿，两者之间的边界非常清晰，而且信号强度对比起来观察，十分的明显，因此，MRI图像能够对肿瘤形态、大小、边缘等准确显示，我们就能够量化的计算强化程度、肿瘤体积以及水肿指数[2]。本研究结果显示，MRI图像能够清楚的观察到脑星形细胞瘤肿瘤体积大小以及瘤周水肿情况，MRI所测得的水肿指数(EI)与该肿瘤病理分级的严重程度增加而增大，两者具有密切的正向相关关系。肿瘤细胞密度与和肿瘤体积正相关，即：肿瘤细胞密度越大，肿瘤体积越大。同时，我们发现，肿瘤细胞密度增大伴有相应的肿瘤血管生成的增多，这在肿瘤侵袭的边缘，新生肿瘤的血管形成较多，间接提示EI的形成与肿瘤侵袭特性和血管生成密切相关。

3.2 免疫组化染色脑星形细胞瘤的侵袭特点是多数局限于向周围脑组织侵袭，它的侵袭方式主要分为有三种[16]：①沿脑白质髓鞘纤维；②沿血管组织发展；③沿神经细胞。该肿瘤的的侵袭特性直接导致该肿瘤术后复发率高，并与患者预后差有直接关系，严重影响该疾病的治疗效果与预后。已有的研究表明，胶质瘤侵袭转移中MMPs破坏了基底膜的完整性，是导致肿瘤侵袭的重要条件，因此，我们推断，脑胶质瘤侵袭转移能力与MMPs的表达水平密切相关。MMPs在肿瘤侵袭转移中作用，从目前的学说来看，主要可以概括为[17-21]：①降解细胞外基质，使细胞物理屏障损坏；②给予细胞粘附力，便于其生长；③降解细胞基质其它成分，可能激发其它因子潜在活性而发挥负面效应；④对细胞外改建，使得肿瘤新生血管的形成加速。

本研究采用免疫组织化学法直接检测68例脑星形细胞瘤病例中基质金属蛋白酶2、9蛋白的表达情况，以反映其在胶质瘤发展过程中的作用，并且对MMPs-2以及MMPs-9的表达与脑星形细胞瘤的瘤周水肿情况关联性进行了分析，以期提高该肿瘤的治疗水平与及科学预后水平，造福患者。

3.3 MMPs-2和MMPs-9的表达与肿瘤病理分级的相关性MMPs-2、MMPs-9与肿瘤新生血管形成有关，在肿瘤侵袭和转移中起着至关重要的作用，肿瘤侵袭过程大致如下：肿瘤细胞首先与基底膜表面受体结合(如FN、LN等)→分泌MMPs等降解酶以对降解基底膜和基质进行降解→肿瘤细胞沿基底膜的缺损处和空隙完成侵袭。本研究结果显示，随着肿瘤恶性程度的提升，基质金属蛋白酶2的表达量亦随之增大，MMPs-2在该肿瘤的表达水平与疾病的严重程度呈现正向关系，另外，Ⅲ～Ⅳ级肿瘤中MMPs-2的表达量明显高于Ⅰ～Ⅱ级，两者比较，差异具有统计学意义(t=7.872，p＜0.05)；另外，与MMPs-2类似地，MMPs-9在我们收集的68例脑星形细胞瘤病例中也均呈阳性表达，MMPs-9的表达与脑星形细胞瘤病理分级的也密切相关，随着脑星形细胞肿瘤恶性程度的上升，MMPs-9的表达量也表现出逐步上升的趋势，Ⅲ～Ⅳ级肿瘤中MMPs-9的表达量明显高于Ⅰ～Ⅱ级，两者比较，差异具有统计学意义(t=5.076，p＜0.05)。

3.4 瘤周水肿与MMPs-2、MMPs-9的表达相关性随着肿瘤病理分级的增大(肿瘤恶性程度的增加)，通过MRI分析发现，脑星形细胞瘤瘤体体积也是逐渐呈现增大的趋势，同时，通过免疫组化分析，我们发现MMPs-2持续的呈现阳性表达，类似的，MMPs-9的表达也有增强的趋势，这说明肿瘤体积与MMPs-2、MMPs-9的表达正相关，进一步证明肿瘤的生长与MMPs-9和MMPs-2的表达密不可分。VEGF是目前已知最强的肿瘤血管生成诱导因子，VEGF能够刺激新生血管生成，而MMPs-2能为新生血管形成提供基架、MMPs-9与VEGF能协同作用，这些因素都促进了肿瘤的血管形成，而新生血管为肿瘤细胞的不断增殖提供所需的营养并排除代谢废物，使得肿瘤侵袭过程加速[21-23]。因此，VEGF的作用也不容忽视。

瘤周水肿是肿瘤侵袭与转移的基础。脑星形细胞瘤中，瘤周水肿是最为常见的影像学表现，水肿程度基本上与其恶性程度正相关，但其发生机制尚不十分明确。目前，多数观点认为胶质瘤瘤周水肿主要表现为血管源性水肿，瘤周水肿在血脑屏障破坏区开始时就已经发生。已有的文献报道表明，VEGF、MMPs-9的表达与脑胶质瘤的瘤周水肿呈正相关[24-25]，但是系统研究人脑星形细胞瘤中MMPs-2和MMPs-9的表达与该肿瘤水肿范围的报道还未有见到。

本研究结果显示，在该肿瘤的病理初级阶段，MRI上仅有少许的水肿信号，说明此时MMPs-2、MMPs-9已经造成血瘤屏障功能紊乱，使血管通透性大大增强，已有少许液体外渗到细胞外间隙，在MRI、T2WI上可以显示。随着肿瘤的进一步侵袭与发展，MRI上可观察到明显的肿瘤周围脑组织水肿信号，水肿始于肿瘤边缘又逐渐消失在正常脑组织内，而MMPs-9、MMPs-2的阳性染色也在肿瘤侵袭的边缘表现更加突出，因此预示着肿瘤细胞分泌的MMPs-2以及MMPs-9与瘤周水肿的形成密切相关。对此现象产生的可能原因做如下分析：肿瘤细胞分泌的MMPs-2、MMPs-9通过降解细胞外基质膜，产生稀疏和空洞区，使得基质膜通透性增高，从而使得血浆和大分子物质渗漏到细胞间隙中，在肿瘤周围聚集，形成广泛的瘤周水肿。已有的少量研究表明，手术前颅脑CT所呈现出的脑星形细胞瘤水肿范围基本上可以代表着肿瘤的实际侵袭范围，可以作为星型细胞瘤侵袭程度的参考指标。肿瘤周围的水肿有利于与侵袭相关的细胞基质及粘附分子运动，从而促进肿瘤细胞侵袭[26]。

本研究将68例病理-实例报告中MMPs-2和MMPs-9表达结果与MRI所表现出的水肿指数运用Spearman法进行相关性分析，结果发现：MMPs-2与MMPs-9表达的阳性率高低与脑星形细胞瘤的瘤周水肿范围明显相关(p＜0.05)，人脑星形细胞瘤中的瘤周水肿范围与其MMPs-2和MMPs-9的表达均呈正相关的关系，同时，本研究也揭示通过MRI图像可间接的反映MMPs-2与MMPs-9的表达情况，可为脑星形细胞瘤的临床诊断提供较为科学的依据。

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(本文编辑: 唐润辉)