生物转化法制备白头翁皂苷A3

曹 体 爽，刘 廷 强，王 东 明，金 凤 燮，鱼 红 闪

（大连工业大学 生物工程学院，辽宁 大连 116034）

0 引 言

白头翁皂苷是中药白头翁重要的活性成分之一，其质量分数在8～10%。其中天然存在的大部分都是多糖基的皂苷，分子质量大，不易于人体吸收利用［1］。白头翁皂苷A3［2］是具有2个糖基的低糖基皂苷，有研究表明，白头翁皂苷A3可保护由于氰化钠及葡萄糖缺乏造成的细胞模型PC－12，减少细胞凋亡。应用流式细胞技术测得浓度分别为0.1、1、10mg／mL的白头翁皂苷A3均可以对细胞起到保护作用［3］。本实验室前期在白头翁皂苷的分离提取［4］、生物转化及其分离纯化［5］方面做了大量工作，发现了白头翁皂苷的提取方法以及对白头翁皂苷具有水解作用的酶。

本实验利用生物转化法，以白头翁总皂苷为底物，制备低糖基皂苷A3，并通过硅胶柱层析及结晶与重结晶等方法对产物白头翁皂苷A3进行精制，为制备高纯度的白头翁皂苷A3提供依据。

1 实 验

1.1 材料与仪器

中药白头翁，购于大连同仁堂药店，产地东北；白头翁A3标准品，广州暨南大学叶文才教授提供。菌种Absidiasp.P00r，由大连工业大学生物学院菌种保藏所提供；薄层层析板Silica Gel 60－F254；硅胶柱；Waters 2695高效液相色谱分析仪。

1.2 方 法

1.2.1 白头翁总皂苷的制备

根据文献［4］所述方法制备白头翁总皂苷。

1.2.2 酶液的制备

根据文献［6］所述方法制备酶液。

1.2.3 白头翁皂苷的生物转化

白头翁总皂苷用20mol／L pH 5.0的HAc－NaAc缓冲液配成质量分数为2%的酶反应底物，加入等体积酶液，40 ℃条件下于5L 反应釜中反应24h。反应液经AB－8脱糖、D－296脱色处理后浓缩蒸干，即得白头翁皂苷酶解产物。

1.2.4 硅胶层析分离白头翁皂苷酶解产物

取制得的白头翁皂苷酶解产物，以3倍样品质量的80～100目硅胶制成样品胶，15倍样品质量的300～400目硅胶做分离胶。用一定量的纯氯仿通柱，按照V（氯仿）∶V（甲醇）＝9.5∶0.5、9∶1、8.8∶1.2、8.5∶1.5 依次进行洗脱。每200mL收集一瓶，并用TLC法跟踪检测。

1.2.5 结晶法纯化白头翁皂苷A3

将硅胶柱分离得到的含白头翁皂苷A3的组分溶于甲醇中，室温放置，自然挥发结晶，得到针状晶体。过滤收集针状物，再将针状晶体用甲醇加热溶解、过滤，不溶物单独收集，滤液放置室温下挥发重结晶，24h 后有针状晶体析出，积累到一定程度时，过滤收集晶体。

1.2.6 HPLC法检测白头翁皂苷A3的纯度

检测器为Waters 2996二极管阵列检测器，Empower 色谱工作站进行检测。色谱柱为Kromasil C18柱（5μm，φ4.6mm×200mm）；进样量，10μL；柱温，35 ℃；体积流量，1.0mL／min；检测波长，205nm。

流动相：乙腈（A）－水（B）；0～10min，φ（A）＝20%～28%；10～20 min，φ（A）＝28%；20～25min，φ（A）＝28%～32%；25～40min，φ（A）＝32%～40%；40～50min，φ（A）＝40%～100%。

2 结果与讨论

2.1 白头翁总皂苷的制备及其生物转化

中药白头翁1 000g经70%酒精浸泡3次，浸提液合并浓缩，再经脱脂、脱糖、脱色后，蒸干洗脱液共得白头翁总皂苷98.6g，得率为9.86%。取白头翁总皂苷50.0g，经Absidiasp.P00r产的粗酶液转化后，经脱糖、脱色处理，得到产物总皂苷34.2g，得率为68.4%。TLC法检测酶水解白头翁总皂苷结果如图1所示。

图1 TLC检测白头翁总皂苷的生物转化结果Fig.1 Result of biotransformation of total pulsatilla saponins

2.2 硅胶柱层析法分离白头翁皂苷A3

利用硅胶柱层析法分离白头翁皂苷A3，根据TLC检测结果，分别收集较纯的各组分，收集情况如表1所示。

表1 白头翁总皂苷A3洗脱分离收集表Tab.1 Fractions of anemoside A3eluted from silica gel

经硅胶柱层析法分别获得了较纯的3种组分。由图2可以看出，3种组分在TLC板中均为单点，与标准品作对照，组分3为白头翁总皂苷A3。

图2 白头翁总皂苷A3单点组分TLC图Fig.2 TLC result of anemoside A3pure fractions

采用HPLC 法检测组分3 中白头翁总皂苷A3的纯度，结果如图3所示。由图3可知，虽然组分3在TLC 上呈现单点，但是在HPLC图谱中显示出2 个吸收峰。其中出峰时间为45.384min与标准品白头翁皂苷A3的出峰时间相近，说明组分3中不仅含有白头翁皂苷A3，还含有一种与白头翁皂苷A3极性相近的物质。因此，需要对A3进行进一步精制。

图3 HPLC法检测组分3中白头翁总皂苷A3的纯度Fig.3 HPLC result of standard of anemoside A3 and fraction 3

2.3 结晶法纯化白头翁皂苷A3

甲醇溶解硅胶柱分离得到的组分3，静置结晶，得到无色针状晶体。晶体经HPLC 检测，第一次结晶并未将组分3 中的2 种物质分开。因此，再用甲醇将第一次结晶得到的样品进行溶解，溶解过程中，发现有一部分白色沉淀物质并不溶解。将不溶于甲醇的部分单独收集、干燥，对不溶物进行HPLC检测，结果如图4所示。

图4 组分3再次结晶产物的HPLC检测结果Fig.4 HPLC result of fraction 3recrystallization

与图3（a）对照可以看出，第二次甲醇溶解时，不溶解部分为白头翁皂苷A3（图4），质量为1.56g，得率为30.59%，纯度达到95.4%以上。硅胶柱分离得到的组分3，第一次甲醇完全溶解。而再结晶获得的晶体物质再用甲醇进行溶解时，大部分并未溶解，从而分离得到了白头翁皂苷A3。这可能是由于组分3中含有其他杂质，第一次结晶时，对白头翁皂苷A3起到了助溶的作用；同时说明组分3中另一种成分在甲醇中的溶解性更好。

3 结 论

50g白头翁总皂苷经生物转化，并经AB－8、D－296脱糖、脱色，可得酶解产物34.2g，得率为68.4%。采用硅胶柱层析法分离纯化白头翁皂苷A3，以V（氯仿）∶V（甲醇）＝9∶1的洗脱剂洗脱出含白头翁皂苷A3及与其极性相近的物质的混合物，得率为15%。经结晶法可以制得纯度为95.4%白头翁皂苷A3，得率为4.56%，达到了对白头翁皂苷A3分离纯化的目的。

本实验以白头翁总皂苷为底物，利用生物转化法成功制备出纯度较高的低糖基白头翁皂苷A3。

［1］金凤燮.天然产物生物转化［M］.北京：化学工业出版社，2009：123.

［2］陈文侃，林强，陈玲，等.中药白头翁的皂苷Ⅳ.主皂苷B4和A3 结构的研究［J］.化学学报，1990，48（5）：501－505.

［3］GAO Xiang－dong，YE Wen－cai，YU A C H，et al.Pulsatilloside A and anemoside A3protect PC12cells from apoptosis induced by sodium cyanide and glucose deprivation［J］.Planta Medica，2003，69（2）：171－174.

［4］刘琳，金凤燮.白头翁皂苷的分离提纯［J］.大连轻工业学院学报，2004，23（1）：18－21.（LIU Lin，JIN Feng－xie.Separation and purification of pulsatilla saponin［J］.Journal of Dalian Institute of Light Industry，2004，23（1）：18－21.）

［5］王伟，唐正军，鱼红闪，等.白头翁皂苷酶解产物的分离纯化［J］.大连轻工业学院学报，2005，24（1）：4－7.（WANG Wei，TANG Zheng－jun，YU Hong－shan，et al.Seperation and purification of Pulsatilla Saponin products by gradient elution and enzyme hydrolysis［J］.Journal of Dalian Institute of Light Industry，2005，24（1）：4－7.）

［6］杨宇，王东明，金凤燮，等.白头翁皂苷糖苷酶的纯化及其酶学性质［J］.大连工业大学学报，2009，28（6）：404－407.（YANG Yu，WANG Dong－ming，JIIN Feng－xie，et al.Purification of pulchinenoside－glycosidase and its enzymatic characteristics［J］.Journal of Dalian Polytechnic University，2009，28（6）：404－407.）