顶空固相微萃取－气相色谱法测定啤酒挥发性风味成分

胡 雯 雯，曹 方，栾 静，孙 玉 梅

（大连工业大学 生物工程学院，辽宁 大连 116034）

0 引 言

已检测出的影响啤酒风味的化合物主要有20余种高级醇和高级酯［1－2］。啤酒风味成分含量低微，通常需要先处理样品再行气相色谱仪分析。目前的样品处理方法主要有溶剂萃取、萃取并蒸馏、超临界流体萃取和静态顶空进样等。这些方法都存在缺陷，如操作繁琐、定量困难、技术要求高、设备昂贵等［3］。固相微萃取集采样、萃取、浓缩于一体，具有操作简便、灵敏度高、重现性好等优点［4］。相关研究显示，风味阈值和含量较高的乙醛、二甲基硫醚、乙酸乙酯、乙酸异丁酯、正丙醇、异丁醇、异戊醇、己酸乙酯和辛酸乙酯等化合物对啤酒风味影响较大，是啤酒香味成分的主要骨架［5－6］。用65μm PDMS／DVB萃取头进行风味物质萃取和测定，效果较好［7－8］。作者采用HS－SPME－GC法测定啤酒中主要风味成分，以模拟酒样为试样，采用响应面法分析，以得到HS－SPME萃取啤酒风味成分的最佳条件。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

1.1.1 主要试剂

乙醛、二甲基硫醚、乙酸乙酯、乙酸异丁酯、乙酸异戊酯、正丙醇、异丁醇、异戊醇、己酸乙酯、辛酸乙酯，色谱纯（纯度＞99%），天津基准化学试剂有限公司；氯化钠，分析纯，天津霸州市化工分厂。

1.1.2 仪 器

65μm PDMS／DVB固相微萃取头及手动进样手柄，Suplco；85－2型恒温磁力搅拌，巩义市英峪予华仪器厂；15mL SPME样品瓶，上海安谱公司；GC－8900型气相色谱仪，山东经纬分析仪器有限责任公司；N2000 色谱工作站，浙江大学智达信息工程有限公司。

1.2 模拟酒样的制备

准确量取二甲基硫醚100μL 和乙酸异丁酯50μL，分别用4%乙醇溶液定容至25 mL。于100mL容量瓶中准确添加乙醛39μL、正丙醇93μL、异丁醇93μL、异戊醇180μL、乙酸乙酯90μL、乙酸异戊酯24μL、己酸乙酯10μL、辛酸乙酯10μL，再添加上述稀释后的二甲基硫醚125μL和乙酸异丁酯250μL，4%乙醇溶液定容至刻度［5－6］。

上述混合溶液即为模拟酒样，依次稀释0、5、10、50、100、500、1 000、1 250、1 500和2 000倍，制作标准曲线。

1.3 HS－SPME的萃取条件

试样预先在4 ℃冰箱冷藏过夜。在15 mL样品瓶中依次加入适量NaCl、7mL试样和转子，用PTFE垫密封，在一定温度的搅拌环境下平衡一段时间，迅速将SPME 萃取头穿过密封垫插入样品瓶，悬于顶空部分，推出萃取头使其暴露于样品瓶的顶空部分，萃取一定时间。萃取结束后，缩回萃取头，立刻取下插入气相色谱仪进样口解析一段时间。

1.4 气相色谱条件

采用FFAP石英毛细管色谱柱（30m×0.32mm，0.5μm）；起始温度40 ℃，保持2min，以8 ℃／min升至130℃，保持5min；FID 检测器；载气为N2，柱前压0.1MPa；进样口温度为250℃，检测器温度为250 ℃。

1.5 Plackett－Burman设计筛选影响萃取条件的显著性因素

采用Plackett－Burman（PB）设计法考察样品体积X1（mL）、搅拌转数X2（r／min）、NaCl质量浓度X3（g／mL）、解析时间X4（min）、萃取温度X5（℃）、平衡时间X6（min）、萃取时间X7（min）对萃取效率的影响［6］，通过Minitab 15数据处理软件以峰面积（Y）大小为响应值考察各因素对萃取峰面积影响的显著性。

1.6 最陡爬坡试验

以PB试验筛选的显著因素试验值变化的梯度方向为最陡爬坡试验的爬坡方向，根据各因素效应值确定变化步长，优化萃取条件，快速逼近最佳区域。

1.7 响应面分析

在最陡爬坡试验基础上确定Box－Behnken（BB）试验的中心点，通过响应面分析法设计并试验，采用多元二次方程拟合因素与响应值间函数关系，进一步优化多因素变量。

2 结果与讨论

2.1 Plackett－Burman设计筛选影响萃取条件的显著性因素结果

以峰面积为响应值，考察影响HS－SPME 萃取条件的7个主要因素。试验设计及结果如表1和表2所示。由结果可知，X3、X5和X7对Y影响显著，所以进一步优化这3个因素。NaCl质量浓度对萃取峰面积变化有显著正效应，萃取温度和萃取时间有显著负效应。为提高萃取峰面积，应加大NaCl的质量浓度，降低萃取温度和萃取时间。

表1 Plackett－Burman试验设计及结果（N＝12）Tab.1 Experimental design and results of Plackett－Burman（N ＝12）

2.2 最陡爬坡试验

根据PB试验筛选出的3个显著因素的效应和比例设计最陡爬坡路径。设定萃取温度步长4 ℃、萃取时间步长5 min、NaCl质量浓度步长0.143g／mL进行最陡爬坡试验。设计及结果如表3所示。最优萃取条件在试验组2和试验组4之间，故以试验组3的条件为响应面试验的中心点。

表2 Plackett－Burman 试验设计的因素水平及其效应分析Tab.2 Levels of variables and analysis of the effect of Plackett－Burman design

表3 最陡爬坡试验设计及其结果Tab.3 The design and results of steepest ascent test

2.3 Box－Behnken试验设计及结果

在最陡爬坡试验的基础上，以试验组3的条件为中心点，采用三因素三水平的响应面分析法进行试验，运用Minitab 15数据处理软件进行回归分析。试验因素水平见表4，试验设计及结果见表5，结果分析见表6。

表4 Box－Behnken试验设计的因素与水平Tab.4 Experimental factors and levels of Box－Behnken design

通过Minitab 15软件分析，建立二次响应面回归模型，确定峰面积的预测值对萃取温度、萃取时间、NaCl质量浓度的多元二次回归方程为Y＝6.093 3－0.323 8A＋0.285 0B＋0.321 3C－0.381 7A2－0.329 2B2－1.286 7C2＋0.402 5AB＋0.130 0AC－0.112 5BC。其中：Y为10种风味成分产生的峰面积总和，A、B、C分别代表萃取时间（min）、萃取温度（℃）和NaCl质量浓度（g／mL）。

表5 Box－Behnken试验设计及结果Tab.5 Experimental design and results of Box－Behnken

表6 模型的方差分析Tab.6 Variance analysis of model

由表6可知，模型回归的P＝0.001，失拟项的P＝0.010，说明模型回归显著，失拟不显著，模型模拟较好，不需要再引入更高次数的项。模型的校正相关系数的平方R2＝98.04%，表明多元二次回归方程的拟合程度较好，萃取峰面积与萃取的条件呈线性关系。因此该模型选择正确，可用于HS－SPME条件优化的理论预测。

2.4 最优条件的确定及响应曲面和等高线分析

利用回归方程求得各因素的最优条件，对回归方程求一阶偏导数等于0，得到方程：

－0.763 4A＋0.402 5B ＋0.13C－0.323 8＝0 0.402 5A－0.658 4B－0.112 5C ＋0.285 0＝0 0.13A－0.112 5B－2.573 4C ＋0.321 3＝0

对方程组联立求解，得出模拟方程的极值点：A＝－0.276，B＝0.247，C＝0.100。因此固相微萃取的最优条件为：15mL样品瓶中加入7mL萃取液并添加0.287g／mL 氯化钠，在48.90 ℃环境下萃取45.12 min，由线性回归方程可以确定最大萃取峰面积为6.19×104。在上述萃取条件下进行验证性试验，测得峰面积的平均值为6.20×104，与回归方程预测结果的误差为0.16%，表明该回归方程能够准确地预测试验结果。

对表5的试验结果进行分析，绘制响应曲面及等高线图，见图1。由图可知，两因子间均成抛物线性关系，有一个极大值，由等高线为椭圆形可直观地看出各因子间的交互影响显著。

图1 响应曲面及等高线图Fig.1 Response surface plot and contour plot

由图1（a）可知，当萃取温度在46～52 ℃时，随着萃取时间的增加，萃取峰面积逐渐增大，当萃取温度超过52 ℃时，萃取峰面积有下降趋势。由于温度升高，被萃取物的扩散系数增大，扩散速度加快，平衡时间缩短；温度过高可能影响某些挥发性组分的稳定性，还会使萃取头的萃取效率下降［6］。

由图1（b）可知，当萃取温度在46～51.2 ℃、7mL样品中添加0.250～0.357g／mL NaCl时，萃取峰面积有最大值（6.0×104以上），继续增加NaCl的质量浓度，则会造成萃取峰面积逐渐下降。增加溶液中的离子强度，会降低被萃取物在溶液中的溶解度，起到盐析作用，有利于被萃取物在涂层上的萃取。NaCl的质量浓度达到饱和点，会引起酯类物质响应值降低，干扰峰增多且产生拖尾峰。

由图1（c）可知，7 mL 样品中添加0.250～0.343g／mL NaCl时，NaCl的质量浓度和萃取时间能较显著地影响萃取峰面积。

2.5 固相微萃取优化条件的有效性验证

在最优萃取条件下测定模拟酒样中的风味成分，通过改变风味成分浓度，经HS－SPME－GC萃取分析，建立检测峰面积与实际浓度之间的线性回归方程（表7）。

由表7可见，该方法在一定质量浓度范围内啤酒中有较好的线性关系，回归方程相关系数R2为97.87%～99.96%，回收率为91.20%～103.46%，标准偏差为1.74%～8.90%，试验精密度较高，说明该方法能较准确地定量分析啤酒中风味成分。

2.6 成品啤酒样品分析

用建立的HS－SPME方法处理3种市售成品啤酒，通过气相色谱法检测10 种风味成分的含量，结果见表8，啤酒样品的典型色谱图见图2。由表8可知，HS－SPME－GC法能有效地检测成品啤酒中乙醛、乙酸乙酯、乙酸异丁酯、正丙醇、异丁醇、乙酸异戊酯、异戊醇、己酸乙酯和辛酸乙酯9种风味成分，由于二甲基硫醚主要存在于大麦芽中，在啤酒中含量甚微（2μg／L），可能是所用的检测器灵敏度达不到这个数量级，所以此法未检出市售啤酒中的二甲基硫醚含量。测定的3种不同品牌啤酒样品中含有的挥发性风味成分各不相同，可能与原料和酿造工艺的不同有关。

表7 HS－SPME－GC检测模拟酒样中10种风味组分的线性范围及回收率Tab.7 Linear range and coefficient of recovery of ten flavor components in synthetic beer sample detected by HS－SPME－GC

表8 成品啤酒中风味成分的质量浓度Tab.8 Concentration of flavor compounds in beer samples

图2 啤酒样品的典型色谱图Fig.2 Typical chromatogram of beer samples

3 结 论

运用Plackett－Burman法筛选出萃取温度、萃取时间和NaCl质量浓度对HS－SPME 萃取效率影响显著，由最陡爬坡试验确定了显著因素的最佳范围，再利用Box－Behnken法设计试验进一步优化，Minitab软件进行回归分析确定最优萃取条件：15mL样品瓶中加7mL萃取液并添加0.287g／mL氯化钠，在48.90 ℃环境下萃取45.12min。验证性试验误差为0.16%。在最优萃取条件下，利用HS－SPME－GC法分析模拟酒样，回收率较高，标准偏差较小，重现性好，精密度高，能够快速、准确、灵敏、安全地应用于啤酒风味成分的定量分析。

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