自噬诱导剂海藻糖对帕金森症小鼠的治疗作用*

吴 锋，秦巨峰

（1南通大学药学院药理系，江苏226001；2南通大学附属医院影像科）

·论著与基础研究·

自噬诱导剂海藻糖对帕金森症小鼠的治疗作用*

吴 锋1**，秦巨峰2

（1南通大学药学院药理系，江苏226001；2南通大学附属医院影像科）

目的：探讨自噬诱导剂海藻糖对帕金森症小鼠的治疗作用。方法：使用1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶盐酸盐（MPTP）建立小鼠帕金森症模型，通过观察小鼠中脑黑质区多巴胺（DA）神经元数量、纹状体内神经递质多巴胺及代谢产物变化，判断海藻糖治疗帕金森症的作用。结果：（1）免疫组化染色发现MPTP使小鼠黑质区DA神经元数量明显减少。海藻糖干预后可增加DA神经元数量。（2）HPLC检测发现MPTP造成小鼠纹状体中多巴胺明显减少，海藻糖组可增加神经递质及代谢物。结论：海藻糖能减少MPTP造成的黑质区DA神经元丢失，增加纹状体中多巴胺的含量，海藻糖能有效治疗帕金森症。

帕金森症；自噬；海藻糖；1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶盐酸盐；免疫组织化学法；小鼠

海藻糖（trehalose）是一种由两个葡萄糖分子以1,1-糖苷键构成的天然非还原性双糖，通过蛋白质-海藻糖相互作用影响蛋白质折叠，对多种生物活性物质具有非特异性保护作用[1]。海藻糖通过非依赖哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信号转导途径诱导自噬，清除神经元内突变型亨廷顿蛋白和α-突触核蛋白对多种神经退行性疾病产生治疗作用[2-3]。帕金森症（PD）是一种中老年常见的慢性进展性神经退行性疾病，它以中脑黑质多巴胺（DA）神经元缺损为主要病理基础。本实验以MPTP制备帕金森症小鼠模型，观察海藻糖能否起到治疗作用，为临床应用提供理论基础。

1 材料和方法

1.1 材料 1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶盐酸盐（1-Methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine hydrochloride，MPTP，sigma，3.5mg·mL-1），溶于0.9%生理盐水溶液；海藻糖（sigma，0.2mg·mL-1），溶于0.9%生理盐水溶液；清洁级雄性C57bl/6小鼠，质量25～30 g，雄性，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，许可证号：SCXK（沪）2003—0003。

1.2 方法 （1）分组：C57bl/6小鼠60只，随机分为4组，每组15只，分别为生理盐水正常对照组、MPTP模型组、海藻糖正常对照组和海藻糖治疗组。MPTP 20mg·kg-1腹腔注射，每隔2h连续注射4次，造模7d后取材。海藻糖2g·kg-1于MPTP最后1次注射后腹腔注射，每隔2d注射1次，同时予2%溶于双蒸水普通喂养[4]，将动物置于放有清洁垫料的饲养盒中，自由饮水、进食。（2）免疫组化检测：7天后小鼠以4%戊巴比妥钠麻醉，顺序灌注PBS（pH值7.4)和

4%多聚甲醛(pH值7.4)，灌流后鼠脑在4%多聚甲醛中后固定6h,冰冻切片机制备中脑区脑片(40μm)。予0.5%Triton x-100透膜，5%山羊血清封闭，酪氨酸羟化酶抗体（1∶2 000）一抗孵育过夜，生物素二抗（1∶500），ABC法用于检测抗原（1∶100），DAB染色拍片。（3）HPLC检测：小鼠断头后迅速取出全脑，在4℃冰浴中迅速分离出纹状体，称重后立即投入液氮中。每10mg组织加0.2mL内标溶液（高氯酸0.1mol/L，3,4二羟基苄胺0.1μg/mL，焦亚硫酸钠0.04%，EDTA0.04%），在冰浴下用玻璃匀浆器匀化1min。然后4℃14 000×离心20min，取出上清液，置于-80℃冻存，每次取20μL注入HPLC进行分析检测。

**[作者简介]吴锋，男，汉族，江苏南通人，生于1980年10月，硕士，讲师。研究方向：神经药理学。

1.3 统计学处理 用SPSS13.0软件分析处理，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK检验，计量数据以±s表示，P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结 果

酪氨酸羟化酶免疫组化染色发现MPTP制备帕金森症小鼠急性模型造成C57bl/6小鼠黑质区DA神经元数量明显减少。海藻糖干预后可以减轻MPTP的急性损伤作用，增加DA神经元数量，见图1（P<0.05）。HPLC检测发现MPTP造成C57bl/6小鼠纹状体中，DA神经元突触投射区内多巴胺及其代谢产物3,4-二羟苯乙酸(DOPAC)和高香草酸(HVA)均明显减少。海藻糖组可以增加上述神经递质及代谢物，见图2～4（P<0.05）。

图1 海藻糖对MPTP帕金森症模型小鼠黑质区多巴胺神经元存活数量的影响

图2 海藻糖对帕金森症小鼠纹状体中多巴胺的影响

图3 海藻糖对帕金森症小鼠纹状体中DOPAC的影响

图4 海藻糖对帕金森症小鼠纹状体中HVA的影响

3 讨 论

目前研究认为帕金森症病因可能是环境因素和遗传因素的共同作用结果，近年来发现线粒体功能缺陷在帕金森症中起重要作用[5]。MPTP模型是通过损伤中脑DA神经元线粒体功能，引发帕金森症的最常用的动物模型。该模型具备成模稳定，制备简单等优点，而且MPTP是目前唯一已知的可以在人类及灵长目动物造成帕金森症的神经毒素[6]。破损的线粒体可增加活性氧（ROS）的释放损伤神经元，所以加速清除已经丧失功能的破损线粒体已经成为帕金森症治疗的新的靶点[7]。自噬是真核细胞特有的生命现象，在一些生理和应激、毒素、饥饿等病理因素的诱导下，由一种前自噬结构形成双层膜结构的自噬泡，延伸包裹待降解的蛋白质、破损细胞器，形成自噬体。然后自噬体的外膜和溶酶体膜融合，形成自噬溶酶体。内膜和包裹的物质进入溶酶体腔，被蛋白水解酶降解，降解后的成分可被细胞循环利用，从而维持了细胞的自身稳定[8]。海藻糖是一种典型的非依赖mTOR信号转导途径的自噬诱导剂，本身作为食品不具备毒性，同时能够加速自噬流帮助清除帕金森症致病因素中的累积的破损线粒体。实验发现在帕金森症病理过程中，海藻糖能够有效遏制黑质区DA神经元丢失，起到治疗帕金森症的目的，但详细机制有待进一步研究。

[1]Chen Q,Haddad GG.Role of trehalose phosphate synthase and trehalose during hypoxia:from flies to mammals［J］.J Exp Biol,2004,207(Pt 18):3125-3129.

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[3]Lan DM,Liu FT,Zhao J,et al.Effect of trehalose on PC12 cells overexpressing wild-type or A53T mutant α-synuclein［J］.Neurochem Res,2012,37(9):2025-2032.

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The Effect of Trehalose,an Autophagy Enhancer, in the MPTP Model of Parkinson’s Disease

WU Feng1,QIN Jufeng2
(1Department of Pharmacology,College of Pharmacy,Nantong University,Jiangsu 226001；1Department of Radiology，Affiliated Hospital of Nantong University)

Objective:To explore the effect of trehalose in the MPTP model of Parkinson’s disease.Methods:The number of surviving dopaminergic(DA)neurons in substantia nigra pars compacta (SNpc)and levels of dopamine and its main metabolites,3,4-dihydroxyphenylacetic acid(DOPAC)and homovanillic acid(HVA)in striatum were evaluated.Results:Trehalose rescued midbrain DA neurons from MPTP toxicity and increased the levels of dopamine,DOPAC,and HVA in striatum.Conclusion:Trehalose could be used for treatment of Parkinson’s disease.

Autophagy;Trehalose;Parkinson’s disease;MPTP

R742.5

A

国家青年科学基金项目（31300893）；南通市科技项目（BK2012094）。

2014-07-03

1006-2440（2014）04-0316-03