ELISA法检测非洲猪瘟抗体实验条件的优化

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（中国动物卫生与流行病学中心/外来动物疫病研究中心，山东青岛 266032）

ELISA法检测非洲猪瘟抗体实验条件的优化

张永强，任伟杰，吴晓东，王筱真，李金明，王志亮

（中国动物卫生与流行病学中心/外来动物疫病研究中心，山东青岛 266032）

本文以灭活非洲猪瘟病毒为包被抗原，分析了包被浓度、酶标二抗、显色底物对ELISA法检测非洲猪瘟抗体的影响，以期获得最适反应条件。以2个阳性血清和一个阴性血清为待检样品，用不同包被浓度、2种酶标二抗和2种显色底物进行ELISA反应，记录吸光值，分析阴阳性样品吸光值差异，优化阴性样品背景值，计算P/N值。结果表明，包被浓度为15µg/mL、二抗为HRP标记蛋白A、显色底物为OPD时，两个阳性样品P/N值分别为4.920和7.259，为本方法的最适反应条件。

ELISA；非洲猪瘟抗体；试验验条件；优化

非洲猪瘟（African swine fever，ASF）是由非洲猪瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）感染引起的猪的一种急性、热性、高度接触性传染病[1]。主要感染家猪、野猪和软蜱，是唯一的节肢动物作为传播媒介的DNA病毒[2]。家猪感染后以全身出血、呼吸障碍和神经症状为主要特征，致死率高达100%[3]。

目前，该病尚缺乏有效的疫苗，防控主要以早发现、早扑灭为主，因此诊断方法的建立和储备在ASF防控中显得尤为重要。Hutchings GH[4]等比较了用全病毒多抗血清和针对VP73蛋白的单抗进行间接夹心ELISA检测ASFV，显示多抗血清的敏感性高于单抗。Vidal MI[5]等用VP73单抗建立的固相ELISA，检测样品VP73的敏感性为0.05mg/ mL，检测病毒颗粒的敏感性为2.3×102PFU/mL。我国研究人员蒋正军等[6]以杆状病毒表达的ASFV P72蛋白为抗原研究和组装了ASFV抗体检测试剂盒。张鑫宇等[7]用原核表达的ASFV P54制备了胶体金试纸条，通过对ASF不同感染时期样品检测，显示该试纸条在感染早期的符合率高于OIE推荐的ELISA检测方法。

本研究以灭活的ASFV E70毒株为包被抗原，对包被浓度、酶标二抗和显色底物种类进行了优化，为后续进行大量样品的验证实验和方法的标准化奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

阳性和阴性血清由中国动物卫生与流行病学中心保存；E70灭活病毒液由西班牙实验室惠赠；HRP标记抗猪IgG、HRP标记蛋白A、显色液均购自SIGMA公司；ELISA板购自NUNC公司；其余为国产分析纯试剂。

1.2 方法

常规方法进行ELISA操作。CBS（pH9.6）稀释病毒液，37℃包被1.5h；洗涤为每次洗涤3遍；封闭为2% BSA（PBST稀释）4℃过夜；阴阳性血清用PBST做200倍稀释，37℃孵育1.5h；酶标二抗用PBST进行10000倍稀释，37℃孵育1h；显色时间为阴性血清孔刚出现颜色变化时加终止液终止。本研究对包被浓度、酶标二抗和显色液进行了优化。

1.2.1 包被浓度

用CBS（pH9.6）稀释灭活ASFV，用于ELISA板的包被，设8个包被浓度，每孔加包被液100μL。

1.2.2 酶标二抗

分别以HRP标记抗猪IgG和HRP标记蛋白A为酶标二抗，进行ELISA反应，选择最适酶标二抗。

1.2.3 显色底物

分别以四甲基联苯胺（TMB）和邻苯二胺（OPD）为显色液，进行ELISA反应，选择最适显色底物溶液。

2 结果

2.1 包被浓度优化

2.1.1 试验1

灭活病毒原液用pH9.6 CBS分别稀释为0.1μg/ mL，0.2μg/mL，0.4μg/mL，0.8μg/mL，1.6μg/ mL，3.2μg/mL，6.4μg/mL，12.8μg/mL，包被ELISA板。以HRP标记抗猪IgG为二抗，TMB为显色底物进行ELISA反应。结果显示，随着包被浓度增加，阳性血清OD值呈升高趋势，阴性血清OD值基本未发生变化，表明增加包被抗原浓度能增加阳性血清OD值（表1）；随着包被浓度增加，P/N值呈升高趋势，但是均低于P/N＞2.1的判定标准（图1）。

表1 不同抗原包被浓度的阴阳性血清OD值

图1 不同抗原包被浓度的P/N值

2.1.2 试验2

提高抗原包被浓度，分别以0.5μg/mL，1μg/ mL，5μg/mL，10μg/mL，15μg/mL，20μg/ mL，25μg/mL，50μg/mL的浓度包被，其它条件同上，进行ELISA反应。结果显示，随着包被浓度增加阳性样品OD值呈升高趋势，包被浓度≥15μg/mL时升高趋势不明显，阴性样品OD值则基本无变化（表2）；随着包被浓度增加，P/N值呈升高趋势，包被浓度从15μg/mL开始，达到了最适浓度，20μg/mL时P/N值突然升高，应该与N在该浓度下OD值过低有关，属于操作误差（图2）。

表2 不同抗原包被浓度的阴阳性血清OD值

图2 不同抗原包被浓度的P/N值

2.2 酶标二抗的优化

以HRP标记蛋白A为酶标二抗，其它反应条件同2.1.2。结果显示，HRP标记蛋白A明显好于HRP标记抗猪IgG（表3）。当抗原包被浓度≥15μg/mL时，P/N值大于2.1（图3）。

表3 不同酶标二抗的阴阳性血清OD值

图3 不同酶标二抗的P/N值比较

2.3 显色底物溶液优化

其它反应条件同2.2，显色液由TMB改为OPD进行ELISA反应。结果显示，阴阳性样品之间OD值的差异进一步扩大（表4）。OPD组P/N值明显优于TMB组（图4）。

表4 不同显色底物溶液的OD值

图4 不同显色底物溶液的P/N值比较

3 结论

本实验通过不断优化，最终确定了最适反应试剂。即包被浓度为15μg/mL至50μg/mL，为了达到既能满足实验要求又节省包被抗原的目的，最终确定15μg/mL为最适包被浓度；HRP标记蛋白A为最适酶标二抗；OPD为最佳显色底物。

4 讨论

一种血清学检测方法的建立，需要对检测方法的特异性、敏感性、重复性、保质期等进行实验和验证，以及通过对大量阳性和阴性样品的检测来计算和确定其临界值等，但是这些工作必须是在优化和确立最适反应条件后进行。本文研究了不同包被浓度、酶标二抗和显色底物对以ASFV E70毒株为包被抗原检测ASF抗体的影响，并最终确定了最优反应条件，为该检测方法的后续研究和验证奠定了基础。

以全病毒作为抗原包被ELISA板检测待检血清中是否存在病毒特异性抗体，特别是中和抗体，具有重要的检测价值。由于附着在ELISA孔底部的病毒抗原成份在空间构象、存在形式、分布和排列方式等方面与侵入机体引起免疫应答的病毒完全相同，所以抗原和抗体间吻合度更强，检测的敏感性更高。但是由于实验过程中需要进行病毒培养和灭活，一旦操作不慎可能造成散毒，因此对实验条件要求比较高，特别是一些危害程度高的病原更是如此。此外，在操作过程中需要注意由于不同批次病毒液中的病毒含量可能不同，病毒液处理过程中对病毒颗粒的损坏程度有所差异，因此需要用标准品对每一批次病毒液进行标准化。

本实验对两种酶标二抗比较后发现，HRP-蛋白A明显优于HRP-antiIgG，提示蛋白A更适合作为本实验的酶标二抗。蛋白A是从A类链菌中分离出来的胞壁蛋白，能与除狗以外的多数哺乳动物的IgG Fc段结合（包括：人、山羊、绵羊、兔、豚鼠、马、猪、猴、小鼠等），不结合人IgM、IgD、和IgA。通常以酶标蛋白A作为二抗，敏感性高于酶标抗抗体的敏感性，但背景值往往偏高。从本实验数据中也可以看出，以HRP-anti-IgG为二抗时阳性血清平均OD值为0.557，阴性血清平均OD值为0.331；以HRP-Protein A为二抗时，阳性血清平均OD值为1.130，阴性血清平均OD值为0.484，HRP-Protein A的值明显偏高。作者猜测原因可能为蛋白A分子量42kD，而IgG分子量150kD左右，因此蛋白A空间体积更小，更容易突破空间位阻与一抗结合，因此敏感性提高，同时也造成了背景值偏高的现象。

此外，本实验对两种显色底物溶液比较后发现，OPD（邻苯二胺）明显优于TMB（四甲基联苯胺）。OPD显色时阴性平均OD值仅为0.108，而TMB显色时阴性平均值达到0.484。两者比较，OPD显色对于降低背景值方面效果明显，虽然OPD也会降低阳性样品的OD值，但是通过两者P/N值的比较可以看出，OPD显色时P/N值明显高于TMB。虽然文献报道[9]，与OPD比较，TMB是一种更优良的显色底物，TMB在灵敏度上高于OPD 4倍以上，但就本实验而言，由于主要问题是背景值太高，因此选择敏感性相对低一些的OPD更为合适。

[1] Costard S，Mur L，Lubroth J，et al. Epidemiology of African swine fever virus [J]. Virus Res，2013，173（1）：191-197.

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[3] Tulman ER，Delhon GA，Ku BK，et al. African swine fever virus[J]. Curr Top Microbiol Immunol，2009，328（1）：43-87.

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[5] Vidal MI，Stiene M，Henkel J，et al. A solid-phase enzyme linked immunosorbent assay using monoclonal antibodies for the detection of African swine fever virus antigens and antibodies[J]. J Virol Methods，1997，66（2）：211-218.

[6] 蒋正军，马世东，蔡丽娟，等.非洲猪瘟间接ELISA诊断试剂盒的研究[J].中国预防兽医学报，2000，22（s1）：107-113.

[7] 张鑫宇，左伟勇，朱善元，等.非洲猪瘟病毒p54抗体胶体金试纸条检测方法的建立[J].中国预防兽医学报，2014，36（4）：281-285.

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Optimizing the Conditions of an Indirect ELISA for Detection of African Swine Fever Virus Antibody

Zhang Yongqiang，Wu Xiaodong，Ren Weijie，Wang Xiaozhen，Li Jinming，Wang Zhiliang

（National Research Center for Exotic Animal Diseases，China Animal Health and Epidemiology Center，Qingdao，Shandong 266032）

In the study，the effects of antigen coating concentration，enzyme labeled antibody and chromogenic substrate in an ELISA with inactivated African swine fever virus as coating antigen were analyzed for detection of ASFV antibody. In order to obtain the optimum reaction conditions，different coating antigen concentrations，2 type enzymelabeled antibody and 2 type chromogenic substrates were used in the ELISA to detect 2 positive serum samples and 1 negative serum sample. The result showed that the optimum reaction conditions were：the antigen coating concentration was 15μg/mL；Protein A-HRP was used as labeled antibody，and OPD as chromogenic substrate and the P/N value of 2 positive serum samples were 4.920 and 7.259.

ELISA；African swine fever virus antibody；test condition；optimization

S858.28；S852.659.1

：A

：1005-944X（2014）11-0097-04

公益性行业（农业）科研专项经费（201103008）

王志亮