不同条件下副溶血弧菌生物膜形成规律及其天然抑制物质的研究

郭 钦，徐海棠，杨龙平，苏春燕，葛占兵

（江苏大学食品与生物工程学院，江苏镇江212013）

副溶血弧菌是海产品主要致病菌之一，能引起鱼虾贝类等多种养殖水产品的疾病，摄入污染了副溶血弧菌的生的或没有完全煮熟的食物易引起以头痛、呕吐、急性腹泻和低烧为症状的急性肠胃炎和败血症[1]。一般可采用抗生素类进行治疗。但研究表明，很多副溶血弧菌具有广谱耐药性，对阿莫西林等抗生素的平均耐药率高于50%[2]，对其他青霉素类、β-内酰胺类、氨基糖苷类、磺胺类、喹诺酮类、头孢类药物也有不同程度的耐药性[3]。

副溶血弧菌的耐药性与多种因素如基因突变、质粒传导抗性基因以及生物膜相关。据报道，细菌以生物膜形式存在时，耐药性可增加10～1000倍[4]。副溶血弧菌能够在固体基质的表面附着生长形成生物膜，这种结构性细菌群落主要由其分泌的胞外多糖或蛋白包裹细菌细胞所组成，对不良环境和各种抑菌物质具有较强的抗性。

研究发现，细菌生物膜的形成受到很多因素的影响，如血清及组织液成分、容量感应、细胞表面成分、生物膜抵抗免疫系统的作用以及培养条件等。目前，很多细菌如铜绿假单胞菌、大肠杆菌、隐球菌等形成的生物膜已经被大量研究，但关于副溶血弧菌生物膜形成特性以及抑制物质的研究报道较少。

本文主要研究致病性和非致病性副溶血弧菌在不同培养条件下生物膜的形成规律及几种天然物质对其生物膜的抑制作用，为揭示副溶血弧菌的致病机理和预防食物中毒提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

副溶血弧菌tdh+毒力菌株VP-41和非毒力菌株VP-Y12、VP-S17、VP-S5、VP-S12 本实验室保存；trh+毒力菌株VP-ATCC17802 中国普通微生物菌种保藏中心；胰蛋白胨、琼脂粉、SDS、大豆蛋白胨、NaCl上海国药集团化学试剂有限公司；茶多酚、大蒜提取物、生姜提取物 南京化学试剂有限公司；TCBS琼脂、脑心浸液琼脂BHI、氯化钠三糖铁琼脂TSI 青岛海博生物技术有限公司。

超净工作台 上海三发科学仪器有限公司；LRH-250型生化培养箱 上海一恒科学仪器有限公司；电子天平 上海精科天平仪器厂；MLS-3020CH型立式全自动高压灭菌锅日本三洋电机；UV-9600型分光光度计 北京瑞利分析仪器有限公司；SHA-B型水浴恒温振荡器 金坛市中大仪器厂；pH计 上海理达仪器厂。

1.2 实验方法

1.2.1 培养基的配制 3%氯化钠胰蛋白胨大豆液体培养基（3%TSA）：胰蛋白胨15g，大豆蛋白胨5g，NaCl 30g，溶解于1000m L水中，调pH 7.2～7.4，121℃灭菌15m in。1%氯化钠胰蛋白胨大豆液体培养基（1% TSA）：胰蛋白胨15g，大豆蛋白胨5g，NaCl 10g，溶解于1000m L水中，调节pH 7.2～7.4，121℃灭菌15m in。

1.2.2 副溶血弧菌的活化培养 从TSI斜面培养基上挑取适量菌体，转接入5m L 3%TSA试管中，37℃恒温振荡培养12～16h，再移取200μL培养菌液到装有新鲜5m L 3%TSA培养液试管中，培养12～16h。

1.2.3 副溶血弧菌生物膜的检测[5]称取0.1g结晶紫加入到100m L的蒸馏水中，混合均匀。在不同时间段取出样品板，轻轻去掉样品孔中的TSA培养液，保留表面生长的生物膜，用蒸馏水冲洗3次，置于60℃干燥箱中干燥至恒重，干燥后的生物膜用0.1%的结晶紫染色5m in，再用蒸馏水冲洗直至洗脱液为无色透明，加入3m L 95%乙醇脱色5min，稀释脱色液到合适的浓度，用分光光度计检测OD590值。

1.2.4 不同条件下副溶血弧菌生物膜的形成和取样

1.2.4.1 不同温度对副溶血弧菌生物膜形成的影响移取活化好的不同副溶血弧菌200μL分别转接至加有5m L TSA培养液的12孔板中，放入37℃和25℃培养箱进行培养，分别于0、24、48、72、96h进行取样，按照方法1.2.3检测生物膜含量。每组设置三个平行。

1.2.4.2 不同盐度对副溶血弧菌生物膜形成的影响移取活化好的不同副溶血弧菌200μL分别转接至加有5m L TSA培养液的12孔板中，每块12孔板一半装有1%TSA培养液，一半装有3%TSA培养液。分别于0、24、48、72、96h进行取样，按照方法1.2.3检测生物膜含量。每组设置三个平行。

1.2.5 天然产物对副溶血弧菌生物膜的抑制实验

1.2.5.1 天然产物的制备 茶多酚浓缩液：0.15g茶多酚于5m L蒸馏水中，混合均匀后121℃灭菌15min；大蒜提取物浓缩液（98%大蒜素）：0.05g大蒜提取物溶于5m L蒸馏水中，混合均匀后121℃灭菌15m in；生姜提取物浓缩液（5%姜辣素）：1g生姜提取物溶于5m L蒸馏水中，混合均匀后121℃灭菌15m in。

1.2.5.2 抑制实验 取28支试管分成4组，分别加入5m L 3%TSA培养液，121℃灭菌15m in，然后接入200μL活化好的副溶血弧菌菌液并混合均匀，每组1支试管为空白对照，其他6支试管分别加入不同浓度的上述四种天然产物（表1），将试管在37℃培养到副溶血弧菌生物膜形成最高的时间，OD590下测量各试管生物膜的值。

表1 不同抑制物质的终浓度Table1 The different concentrations of inhibitory substances

2 结果与分析

2.1 副溶血弧菌生物膜的形成规律研究

2.1.1 不同副溶血弧菌形成生物膜的情况 在12孔板中，6株副溶血弧菌基本都能形成生物膜，但形成能力各不相同。其中形成生物膜能力最强的为VPS17（图1），其可以在液体培养基表明形成一层较为完整的生物膜；最差的是trh+阳性菌株VP-ATCC17802，在25℃和1%盐浓度下前期基本不形成生物膜；其他菌株皆有不同形成生物膜的能力。

图1 不同条件下副溶血弧菌培养48h形成的生物膜Fig.1 The biofilm of Vibrio parahaemolyticus in different conditions after 48h cultivation

在培养过程中观察发现，1%盐浓度的TSA培养液中，副溶血弧菌产生的生物膜会沉淀到培养液的底部，而3%盐浓度的TSA培养液中，只在培养后期（96h后）才会出现部分生物膜开始沉淀的现象。生物膜的过程包括形成、成熟和老化三个阶段[5]。使用共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）观察多种细菌生物膜形成过程发现，细菌生物膜结构由单层细胞逐步向多层致密细胞结构发展，最底层为旧细胞，往上为新生细胞，生物膜各层同一部位的细胞间存在多处间隙，为营养物质和代谢产物的流入/流出提供空间结构[6]。副溶血弧菌是嗜盐菌，其细胞壁对盐浓度存在依赖性，钠离子浓度过低易造成细胞壁破碎，最终导致细胞裂解[7]。低盐浓度下氯化钠较快消耗完毕，生物膜底层细胞开始衰亡，使其生物膜逐渐老化，最后结构松散开始沉淀，表明盐浓度通过促进细胞生长而间接维护生物膜的三维结构。

2.1.2 不同温度和盐度下副溶血弧菌生物膜的形成规律 菌株、温度和盐度是影响副溶血弧菌生物膜形成的重要因素。分别测定25℃和37℃、1%和3%盐浓度下8株不同副溶血弧菌生物膜的形成规律，结果如图2～图8所示。

2.1.2.1 非致病副溶血弧菌生物膜生长形成规律 非致病副溶血弧菌VP-Y12、VP-S17、VP-S5、VP-S12的生物膜形成规律基本相似（图2）。不同温度下VP-S12生物膜皆随培养时间延长呈快速增长趋势，3%盐浓度下72h左右生物膜达到最大，之后开始下降。1%盐浓度下生物膜生长较慢，表现为持续增长的趋势。25℃下刚开始3%盐浓度下VP-S12的生物膜形成量低于1%浓度，48h后才超过。

图2 不同温度和盐度下VP-S12生物膜生长趋势Fig.2 The biofilm growth trend of VP-S12 at different temperatures and salt concentrations

图3显示，37℃不同的盐浓度下，VP-S5的生物膜形成生长趋势基本都呈缓慢上升趋势，但3%盐浓度的生物膜量明显高于1%盐浓度。25℃时，48h前盐浓度对生物膜形成影响不大，之后3%盐浓度的生物膜生长速度明显高于1%，并且在96h达到最大值。

图3 不同温度和盐度下VP-S5生物膜生长趋势Fig.3 The biofilm growth trend of VP-S5 at different temperatures and salt concentrations

图4可以看出，37℃、3%盐浓度下，72h之前VPS17生物膜形成量呈快速上升趋势，72h以后生物膜的量开始下降；而37℃、1%盐浓度下生物膜形成量在48h时达到最大。25℃下，1%和3%盐浓度的生物膜形成变化趋势和37℃、1%盐浓度基本一致。

图4 不同温度和盐度下VP-S17生物膜生长趋势Fig.4 The biofilm growth trend of VP-S17 at different temperatures and salt concentrations

图5表明，随培养时间的延长，37℃下3%盐浓度的VP-Y12生物膜的形成随时间迅速增加，72h达到最高峰，此后快速下降；1%盐浓度下的生物膜变化则比较平缓。3%盐浓度生物膜量显著高于1%盐浓度产生的生物膜。25℃、3%盐浓度时，VP-Y12的生物膜48h前形成速度较慢，48～72h快速增长，72h达到最高峰，之后明显下降；而25℃、1%盐浓度下的生物膜则随着时间的延长一直呈现缓慢上升趋势。

图5 不同温度和盐度下VP-Y12生物膜生长趋势Fig.5 Biofilm growth trend of VP-Y12 at different temperatures and salt concentrations

从研究中看出，不同类型副溶血弧菌生物膜对温度和盐度的要求基本一致，在盐浓度相同的情况下，37℃培养所形成的生物膜含量明显高于25℃；温度相同的情况下，3%盐浓度下副溶血弧菌比1%浓度下培养的菌株形成生物膜能力更强。这说明在满足副溶血弧菌生长的前提内，温度和盐浓度对副溶血弧菌生物膜的形成有关键作用，高盐、高温有助于副溶血弧菌生物膜的形成，这个结论和陈珍的研究相似[5]。有研究认为，生物膜的形成跟细菌粘附相关，生物膜含量随菌体浓度升高而增加[8]，但本研究发现，在最适合副溶血弧菌生长的25℃[9]，其生物膜含量反而低于37℃，这说明菌体浓度只是生物膜形成的关键性因素之一。

2.1.2.2 tdh+副溶血弧菌生物膜生长形成规律 副溶血弧菌分为非致病和致病性两种，致病性副溶血弧菌可以分泌不耐热溶血毒素（TLH）和耐热性直接溶血素（TDH）或耐热性直接溶血素相关的溶血素（TRH），其中TDH和TRH是引起副溶血弧菌食物中毒的主要原因[10-11]。研究表明，携带tdh毒力基因的致病性副溶血弧菌的生物膜形成规律与非致病菌基本相似。随培养时间延长，VP-41的生物膜含量逐渐增加，37℃、3%盐浓度下生物膜量72h后开始下降，而1%盐浓度下48h后就慢慢减少。3%盐浓度生物膜量明显大于1%盐浓度产生的生物膜。25℃、1%盐浓度时，VP-41的生物膜48h之前呈现缓慢增长趋势，以后开始下降；而3%盐浓度的生物膜一直呈缓慢上升趋势（图6）。

图6 不同温度和盐度下VP-41生物膜生长趋势Fig.6 Biofilm growth trend of VP-41 at different temperatures and salt concentrations

2.1.2.3 trh+副溶血弧菌生物膜生长形成规律 图7表明，在不同的温度和盐度下，VP-ATCC17802在96h内生物膜的形成量一直随时间增长呈上升趋势，且1%盐浓度下生物膜的形成量明显低于3%盐浓度。48h以后生物膜的形成速度快速增加。3%盐浓度时，最后37℃比25℃形成的生物膜含量更高。

图7 不同温度和盐度下VP-ATCC17802生物膜生长趋势Fig.7 The Biofilm growth trend of VP-ATCC17802 at different temperatures and salt concentrations

在培养条件相同的情况下，副溶血弧菌trh+菌株和非致病菌株生物膜形成规律略有区别。trh+菌株VP-ATCC17802生物膜含量随培养时间的延长一直不断上升，而tdh+菌株VP-41和非致病菌株VP-S5、 VP-S12、VP-S17、VP-Y12在培养48～72h时生物膜达到成熟阶段，之后开始下降。本研究表明，非致病菌株形成生物膜能力可能要强于致病性菌株，其中原因尚不清楚。携带trh和tdh毒力基因的菌株皆具有溶血毒性、肠毒性和细胞毒性，是食物中毒的主要原因。但最近研究报道，不携带毒力基因的非致病菌株也可以造成急性肠胃炎等食物中毒症状，具体致病机制尚不明朗[12]，推测可能跟生物膜的形成能力相关。生物膜形成能力强的菌株耐肠道环境能力较强，更易在肠道存活和大量繁殖，从而造成急性肠胃炎等中毒症状。

2.2 不同的天然产物质对副溶血弧菌生物膜形成的影响

很多天然产物都对副溶血弧菌有一定的杀灭作用，同时可能对致病菌生物膜的形成也有抑制作用。本实验使用生姜提取物、大蒜提取物和茶多酚测试其对副溶血弧菌生物膜形成的影响。

2.2.1 大蒜和生姜提取物对副溶血弧菌生物膜形成的影响 选取形成生物膜能力最强的副溶血弧菌VP-S17进行研究。图8可以看出，当大蒜和生姜提取物的浓度低于1%时，随浓度增加，生物膜生成量迅速下降，大蒜提取物的抑制作用稍高于生姜提取物；之后随着浓度的增加，生物膜形成量下降速度逐渐趋于平缓，当两者的浓度超过2%后，对副溶血弧菌生物膜的抑制作用基本不再变化。

图8 大蒜和生姜提取物对生物膜生长的影响Fig.8 The effects of garlic and ginger extracton biofilm growth

大蒜提取物的主要有效成分是大蒜素，可通过降低细菌的粘附率和产胞外多糖的能力抑制多种微生物生物膜的形成[13-14]。生姜提取物的有效成分为姜黄素，可以在不影响变形链球菌生长的情况下抑制其生物膜的形成[15]。本研究发现，大蒜和生姜提取物对副溶血弧菌生物膜的形成也有较强的抑制作用，浓度越高，抑制越明显。

2.2.2 茶多酚对副溶血弧菌生物膜形成的影响 茶多酚对副溶血弧菌生物膜的形成影响较大。图9表明，当茶多酚的浓度低于0.5%时，TSA培养基内液体变浑浊，表明有副溶血弧菌生长，但并没有生物膜形成；当茶多酚浓度高于0.5%时，TSA培养基中基本没有浑浊，而底部出现沉淀。这说明高浓度茶多酚（＞0.5%）也许通过抑制副溶血弧菌的生长从而抑制生物膜的形成，而低浓度的茶多酚则可能通过其他机制抑制生物膜的形成，推测可能主要是其儿茶素类的物质干扰细菌群体感应中信号分子的合成从而影响细菌成膜能力[16]。

图9 茶多酚对生物膜生长的影响Fig.9 The effectof polyphenols on biofilm’formation

3 讨论

研究表明，黑木耳提取物能抑制大肠杆菌生物膜的形成[17]，黄芩和茶树油能抑制金黄色葡萄球菌生物膜的形成[18-19]。很多天然产物如丁香、桂皮等香辛料以及醋、酒精、茶多酚都能抑制副溶血弧菌的生长[20-21]，但对其生物膜形成的影响尚无报道。本文选择的3种天然产物大蒜提取物、生姜提取物和茶多酚，其中，茶多酚能有效抑制副溶血弧菌菌体的生长和生物膜的形成，但具体结果与其浓度相关。低浓度的茶多酚（＜0.5%）仅能抑制生物膜的形成，但不影响副溶血弧菌的生长；高浓度的茶多酚（≥0.5%）则基本抑制了副溶血弧菌的生长从而抑制了生物膜的形成。大蒜提取物和生姜提取物对副溶血弧菌生长影响较少，但都能有效抑制其生物膜形成，且抑制作用随浓度增加而提高，较合适的抑制浓度为1%～2%。天然产物抑制生物膜形成的机理目前尚不明确，但生物膜的形成需要菌体分泌大量的多糖和黏性物质来维持其三维结构，大蒜提取物等天然产物加入到培养基后，一方面抑制了菌体的生长，导致其分泌胞外多糖量下降，空间结构无法维持；另一方面可能影响了菌体的群体效应（QS）调控系统因子的表达，使得信号分子无法感应细菌群体的密度，导致生物膜无法形成[22]。

4 结论

副溶血弧菌一般在培养48～72h时生物膜达到成熟阶段，之后开始下降。副溶血弧菌形成生物膜的含量与菌株和培养条件相关，高盐浓度和高温有助于其生物膜的形成，副溶血弧菌非致病菌株生物膜的形成量高于致病性菌株。

大蒜提取物和生姜提取物能有效抑制副溶血弧菌生物膜的形成，且抑制作用随浓度增加而增加，两者较合适的抑制浓度为1%。茶多酚能有效抑制副溶血弧菌菌体的生长和生物膜的形成。低浓度的茶多酚（＜0.5%）仅能抑制生物膜的形成；高浓度的茶多酚（＞0.5%）则基本抑制了副溶血弧菌的生长，从而抑制了生物膜的形成。

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