山奈酚清除DPPH自由基的新型微量光度滴定方法研究

刘 萍，高云涛*，张丽珠，张宏教，虞姣姣，茶家伟

（1.云南民族大学化学与生物技术学院，云南昆明 650500；2.云南民族大学民族药资源化学国家民委-教育部重点实验室，云南昆明 650500）

人体的许多疾病与衰老都与自由基氧化损伤有关[1]，从天然物质中寻找高效低毒的抗氧化活性物质受到广泛的关注，自由基的发生与检测是抗氧化活性评估的关键，目前用于评估天然抗物抗氧化活性的自由基的发生体系包括羟自由基Feton体系、超氧自由基邻苯三酚自氧化体系、超氧自由基电化学发生体系和人工合成的1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基等[2-3]，检测方法有分光光度法、电化学检测法、高效液相色谱质谱法（HPLC）、气质联用法、化学发光法（CL）和电子顺磁共振（EPR，或ESR）[4-9]等，DPPH自由基是种很稳定的氮中心的自由基，其反应变色敏锐，且浓度与吸光度线性关系好，适合分光光度检测，具有操作快速、准确且稳定可靠等特点，广泛应用于评价天然物质抗氧化活性中[10-14]。但常规分光光度检测样品消耗量大，方法的准确性尚未有文献系统的研究，不适合天然产物研究中的微量成分研究。在天然产物分离中，很多时候所获得活性成分通常少于1mg，因此，发展活性成分抗氧化活性微量化检测方法具有重要价值。酶标仪-微孔板方法目前报道的主要微量化方法，王丽等[15-16]研究了芦丁清除DPPH·的酶标仪-微孔板微量筛选模型，能快速、准确地对微量天然产物单体化合物的抗氧化性进行筛选。本实验室李晓芬等[17]提出一种植物多酚清除 DPPH自由活性的微量电化学滴定方法，提出了以植物多酚与 DPPH自由反应的化学计量关系评价其抗氧化活性的新思路。但目前抗氧化活性的微量化检测方法仍然有限，且上述方法需要专门的仪器，不易普及。

本文基于光度滴定方法原理，以山奈酚[18]为研究对象，提出一种新型活性成分清除DPPH·的微量光度滴定法，方法结合了分光光度法灵敏度高及滴定分析准确好的优点，以微量进样器在DPPH溶液中滴加活性成分，记录滴定过程中DPPH·的吸光度变化，确定活性成分与DPPH·反应的化学计量关系，以此评价活性成分清除DPPH·的能力，并通过与常规DPPH·清除检测方法进行了对照方法验证。研究表明，本文提出的 DPPH·清除活性的微量光度滴定法样品使用量明显下降，具有准确性好、简单、易于普及、成本低等特点，应用前景较好，为抗氧化活性的微量化检测提出了一种新的思路。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

8453型UV-Vis分光光度计 美国安捷伦公司；7200 型紫外-可见分光光度计 北京瑞利分析仪器公司；10mm和30mm比色皿 宜兴市晔辉玻璃仪器厂；AS3120A超声清洗器 天津奥特赛恩斯仪器有限公司；AL204电子天平 郑州南北仪器有限公司；10μ微量进样器 上海高鸽（±0.1μL）。

DPPH（1,1-di-phenyl-2-picryhydrazyl，纯度＞99%） 购于美国 Sigma公司，以乙醇溶解，配制为2.54×10-4mol·L-1（0.1mg·m L-1），于4℃储存，48 h内使用，使用时用乙醇稀释为所需浓度；山奈酚标准品 购于国药集团浙江华东医药有限公司，纯度＞98%，使用时以乙醇溶解，配制为3.49×10-4mol·L-1（0.1mg·m L-1），于4℃储存；无水乙醇 天津市风船化学试剂科技有限公司；所用试剂均为分析纯。

1.2 方法

1.2.1 微量光度滴定法

微量光度滴定法使用可见分光光度计，30cm比色皿以获得较大测定体积，减少相对误差。配制不同浓度的DPPH标准溶液系列，于30mm的比色皿中，测定DPPH溶液在517nm处的吸光度值，计算浓度与吸光度关系回归方程。经测定，本文吸光度与DPPH溶液浓度的关系回归方程为：A=0.0892cD+0.0056（r=0.9994），式中，A为吸光度，cD为DPPH溶液浓度。

另取一定浓度的DPPH溶液至30mm的石英比色皿中，用微量进样器以每次10μL逐渐滴加一定浓度山奈酚溶液，混匀，盖上比色皿盖，待反应3min后，记录滴加山奈酚后DPPH溶液在517nm处的吸光度值，绘制山奈酚加入量与DPPH溶液吸光度变化的测定曲线，根据吸光度与DPPH溶液浓度的关系计算溶液中剩余DPPH溶液浓度（c1），结合根据DPPH溶液初始浓度（c0）计算与山奈酚反应的DPPH·物质的量：nD（mol）=（c0- c1）V，V为溶液体积（m L），绘制山奈酚累积加入量nK（mol）与所消耗DPPH·物质量nD的关系曲线。

考虑DPPH溶液的不稳定性，实验应该尽量在避光条件密闭条件下进行。

1.2.2 DPPH·清除试验

用于对照试验的DPPH·清除试验采用常规方法，见文献[19-20]。在避光条件下，取一定浓度DPPH溶液至10m L比色管中，分别加入不同浓度的山奈酚溶液，混匀，加比色皿塞，待反应20min后，测定其在517nm处吸光度（Aj），测定试剂空白溶液吸光度（A0）以及相应山奈酚溶液吸光度（Ai），计算DPPH自由基清除率（E）。

2 结果与分析

2.1 吸收曲线及反应时间

DPPH·的光度分析通常以DPPH溶液在517nm处的褪色反应为基础，若所测定的活性物质在517nm附近也存在吸收，则可能对DPPH·光度测定带来干扰，所以需考查所研究样品对DPPH·光谱吸收的影响。DPPH·和山奈酚溶液UV-Vis光谱测定结果见图1，DPPH·在328、517nm处有两个强吸收峰，与文献[19]一致。而山奈酚溶液则在267、368nm处有两个吸收带，山奈酚的的光谱吸收对DPPH·在517nm处的吸收无干扰。图1表明，DPPH溶液中与不同浓度的山奈酚反应后，DPPH在517nm处的吸收逐渐降低，并呈剂量-效应关系。因此，通过测定DPPH溶液在517nm处的褪色反应，可准确反应山奈酚对DPPH·的清除作用。

图1 DPPH、山奈酚的吸收曲线以及DPPH与不同浓度山奈酚反应的吸收光谱曲线Fig.1 UV-Vis absorption spectrogram of DPPH and kaempferol，and DPPH w ith different concentrations of kaempferol

滴定分析是基于滴定剂与被滴定物质反应达平衡时的计量关系为基础，而不同的活性物质与DPPH·反应达到平衡的时间可能存在着差异性，反应到达平衡后进行测定才能保证测定的准确性。鉴于此，本文首先考查了DPPH溶液在测定条件下的稳定性，研究表明：室温下（21℃）DPPH溶液在1 h内具有良好的稳定性，但在见光和敞开的条件下，放置时间超过1h，新鲜配制的DPPH溶液紫红色将变浅，吸光值下降，放置5h和10h后，DPPH溶液吸光度仅分别约为初始值的4/5和3/5。为确保结果的准确性，实验应在避光且使用带盖比色皿，在避光及带盖比色皿条件下，2h内，新鲜配制的DPPH溶液吸光值基本保持不变，所以实验应该低温避光，上盖且尽快完成。

由于不同浓度的活性物质与DPPH的反应有可能存在差异，本文以0.005mg·m L-1DPPH溶液与两种浓度水平的山奈酚（高浓度为 0.0035mg·m L-1，低浓度为 0.0005mg·m L-1）进行反应，研究反应时间对山奈酚与DPPH·反应的影响，结果见图2。在0.005mg·m L-1DPPH溶液中加入高低浓度的山奈酚，吸光度迅速减小，但达到反应平衡的时间不同。加入0.0005mg·m L-1山奈酚，10min后吸光度到达稳定，而加入 0.0035mg·m L-1山奈酚后迅速下降，3min后吸光度几乎不变，说明 0.005mg·m L-1DPPH与0.0005mg·m L-1和0.0035mg·m L-1山奈酚反应达平衡时间分别为10min和3min，即浓度增加，山奈酚与DPPH·反应达到平衡时间将延长。本文的研究中，为保证在山奈酚与DPPH·反应达到平衡时进行测定，微量光度滴定法因每次加入的山奈酚量很小，所以选择在加入后3min进行测定，而在对照试验中，因加入山奈酚量相对较大，选择在加入后20 min进行测定。

图2 反应时间对山奈酚与DPPH反应的影响Fig.2 The effect of reaction time on the absorbance of DPPH reacting w ith kaempferol

2.2 微量光度滴定曲线及化学计量关系

根据 1.2.1方法，本文选择了高（22.82×10-8mol/10m L）、中（15.22×10-8mol/10m L）和低（7.60×10-8mol/10m L）3个初始浓度的DPPH溶液，测定山奈酚对3种浓度的DPPH·的滴定曲线（DPPH浓度的选择原则是尽量使其吸光度值在0.3～0.8之间，以保证测定的精度）。结果见图3。从图中可知，与山奈酚反应后，DPPH·在 517nm的吸光值呈线性下降，但山奈酚加入量达到一定浓度时，滴定曲线出现1个拐点，DPPH·吸光度趋于稳定，表明山奈酚清除DPPH已达最大，滴定曲线的拐点可视为滴定终点，对滴定曲线拐点前的线性部分作回归分析，对于高、中、低三个浓度的 DPPH·，线性回归方程分别为 A=-0.0247x +0.8377（R2=0.9994）、A=-0.0235x +0.5464（R2=0.9995）和 A=-0.0226x +0.2977（R2=0.9992）。式中，A为DPPH·在517 nm处吸光度，x为山奈酚浓度，R2为相关系数，三个的相关系数R2值可看出，滴定曲线线性关系良好，精密度较高。

图3 微量光度滴定曲线Fig.3 The curve of micro-photometric titration

依照1.2.1方法，分别计算出不同DPPH·初始量山奈酚加入量nK及所消耗的DPPH·物质量nD的关系，结果见图4。nK与nD的关系曲线，该曲线的线性部份反映了滴定过程山奈酚与DPPH·的化学计量关系，滴定终点时（拐点）对应的DPPH·消耗量（nDmax）则反映了山奈酚能清除的最大DPPH·量，通过nDmax可以计算山奈酚对DPPH最大清除率ECmax，ECmax=nDmax/n0，式中，n0为DPPH初始量。从图4可知，到达滴定终点前，尽管DPPH初始量不同，nK与nD曲线均具有良好的线性关系，且三条曲线几乎重叠，说明反应过程中山奈酚均遵循几乎相同的化学计量关系与DPPH进行反应。本文以DPPH消耗量nD与山奈酚加入量nK化学计量数比（nD/nK）[21]表示这种化学计量关系，表1是不同DPPH初始量滴定过程中的nD/nK和ECmax计算结果。从表1可知，在滴定过程中，随着山奈酚逐渐加入，nD/nK几乎不变，且不同DPPH起始量的nD/nK并无显著差异，当DPPH初始量(×10-8mol)为7.60、15.22和22.82时，山奈酚对DPPH最大清除率ECmax（nDmax/n0，100%无明显差异，分别为：82.89%，84.88%和84.22%，说明滴定过程中nD/nK和nDmax/n0不因DPPH浓度不同而变化。表1可看出，测定精密度依DPPH初始量增加而增加，不同DPPH初始量(×10-8mol)的相对标准偏差（RSD %）顺序是：22.82（2.75）<15.22（3.29）<7.60（5.66），说明过低的DPPH起始量不利于测定的精密度与准确性。

图4 山奈酚加入量（nK）及所消耗DPPH量（nD）的关系Fig.4 The relationship of Kaempferol dosage (nK) and the amount consumed of DPPH (nD)

山奈酚与DPPH的化学计量关系反映了山奈酚清除DPPH的能力，常规自由基清除试验以清除率达50%时抗氧化剂浓度（EC50%）表达其清除自由基的能力，但EC50%随自由基的初始量而明显不同，目前文献所报道的DPPH清除试验中，DPPH初始量不尽相同，因此，所获得的EC50%值不具有可比性。而本文提出的微量光度滴定法以滴定过程中抗氧化剂与DPPH的化学计量数比不随DPPH初始量相同而变化，因此，化学计量数比表达其清除自由基的能力更加合理，可比性好，且本文的方法所获得的化学计量数比精密度好，结果更可靠。

表1 微量滴定过程化学计量数比（nD/nK）、最大清除率（ECmax）和半数清除率（EC50%）测定结果Table.1 The results of stoichiometric ratio (nD / nK), the maximum scavenging rate (ECmax) and half of the scavenging rate (EC50%) of micro-photometric titration

15.22 1.78 1.77 1.72 1.72 1.79 1.72 1.74 1.79 1.88 1.82 1.89 1.88 1.87 1.80 1.77 1.72 1.78 3.29 84.88 0.0428 22.82 1.63 1.66 1.66 1.69 1.70 1.77 1.76 1.76 1.78 1.80 1.77 1.81 1.81 1.80 1.78 1.79 1.79 1.74 1.74 1.76 1.73 1.78 1.79 1.80 1.80 1.82 1.81 1.82 1.80 1.76 1.75 1.73 1.76 2.75 84.22 0.0648

2.3 对照试验

对微量光度滴定法与常规DPPH清除分光光度法进行对照试验，目前文献报告的常规方法DPPH的浓度不尽相同，选择的依据是保证测量条件下具有一定初始吸光度（A0,通常在0.5～0.7之间），以保证测定的准确性。在本文的研究中，常规方法与微量光度滴定法选择的比色皿分别为1.0cm和3.0cm，因此，常规方法和微量光度滴定法DPPH初始量分别为7.1×10-4mmol（浓度为0.142mmol/L，A0为0.74）和2.1×10-7mol（浓度为0.042mmol/L， A0为0.68）。对照试验的结果见表2。从表2可知，尽管计算方法不同，但本法与常规方法的最大清除率ECmax和半数清除浓度EC50%（相当于常规方法DPPH初始量）结果相近，而本文的ECmax和EC50%测定结果相对标准偏差（RSD）更低，说明本法具有正好的精密度，按照表2 DPPH初始量，对本法进行连续5d测定，测得nD/nK和EC50%的RSD值为4.17%。从山萘酚消耗量看，常规方法需使用DPPH样品系列以测定不同剂量山萘酚的清除作用，而本法通过在同一个DPPH样品中滴加微量山萘酚，完成一组测定时山萘酚及 DPPH消耗大大减少。以芦丁作为对照，在相同条件下用本法测定了芦丁的nD/nK、ECmax（%）和EC50%，从结果看山奈酚的nD/nK略高于芦丁，EC50%略低于芦丁，表明山奈酚抗氧化活性略高于芦丁，抗氧化活性较好。

表2 常规方法与本法试验结果对照Table2 The results of general and this new method comparison

3 结论

本文提出一种新型活性成分DPPH自由基清除活性的微量光度滴定法，通过山奈酚清除DPPH自由基的紫外-可见吸收光谱学特征研究，确定了山奈酚对DPPH自由基在517nm处的吸收无光谱干扰，研究了常规方法和本法的山奈酚与DPPH的反应时间分别为20min和3min，其反应达到平衡，确定了山奈酚与DPPH反应的化学计量关系为1:1.78，以此评价活性成分清除DPPH自由基的能力。通过与常规DPPH清除检测方法进行对照对方法进行了验证，结果表明本文提出的DPPH自由基清除活性的微量光度滴定法样品使用量明显下降且更精确，具有准确性好、简单、易于普及、成本低等特点，应用前景较好，为抗氧化活性的微量化检测提出了一种新的思路。

[1] Li J W，Liu Y F，Fan L P，et al.Antioxidant activities of polysaccharides from the fruiting bodies of Zizyphus Jujuba cv Jinsixiaozao［J］.Carbohydrate Polymers，2011，84( 1) : 390－394.

[2] Mokbel M S, Hashinaga F.Evaluation of the antioxidant activity of extracts from buntan (Citrus grandis Osbeck) fruit tissues[J].Food Chemistry, 2006, 94(4): 529-534.

[3] Locatelli M，Gindro R，Travaglia F，et al.Study of the DPPH scavenging activity: development of a free software for the correct interpretation of data[J].Food Chemistry，2009，114 ( 3 ) :889－897.

[4] 张美艳，刘洋.绞股蓝茶脂溶性提取物的气质联用分析及其抗氧化活性研究[J].食品工程，2012,15（5）：105-107.

[5] 方玲玲，肖作兵，牛云蔚，等.超高效液相色谱串联质谱法测定樱桃酒中的5种酚酸[J].食品与发酵工业，2011，37（6）：172-176.

[6] 程宏英，曹玉华.毛细管电泳-电化学检测法测定硫酸铜-维生素C反应体系中的羟基自由基和菊花的抗氧化活性[J].色谱，2007，25（5）：681-685.

[7] Kopani M，Celec P，Danisovic L，et al.Oxidative stress and electron spin resonance[J].Clinica Chimica Acta，2006，364(1-2)： 61-66.

[8] 文镜，刘璇，赵建.荧光法及化学发光法在保健食品抗氧化体外实验中的应用[J].中国酿造，2009( 11)：130-133.

[9] Ono R，Odt T.Measurement of hydroxyl radicals in pulsed corona discharge [J].J Electrostat，2002，55（3-4）：333-342.

[10] Wettasinghe M，Shahidi F.Scavenging of reactive-oxygen species and DPPH free radicals by extracts of borage and evening prim rose meals [J].Food Chemistry，2000，70( 1)：17-26

[11] 王玉丽，任海伟，李志忠等.用清除DPPH自由基法评价药黑豆色素的抗氧化能力[J].食品工业科技，2008，30（8）：102-105.

[12] 郑善元，陈填烽，郑文杰等.单丛茶水提物清除DPPH和ABTS自由基的光谱学研究[J].光谱学与光谱分析，2010，30（9）:2417-2423.

[13] Larrauri J A，Sanch ez-Moreno C，Saura-Calixt O F.Effect of temperature on the free radical scavenging capacity of extracts from red and white grape pomace peels[J].J Agric Food Chem，1998，46（7）：2694-2697.

[14] Yokozaw A T，Dong E，Natagaw A T，et al.In vitro and in vivo studies on the radical-scavenging activity of tea[J].J Agric Food Chem，1998，46（6）：2143- 2150.

[15] 戴 云，邱晓燕，何耀莹，等.齐墩果酸和熊果酸对DPPH自由基的清除作用[J].云南民族大学学报(自然科学版)，2012，21(6)：395-398.

[16] 王丽，张丽，康文艺，等.芦丁清除DPPH自由基微量模型建立[J].食品工业科技，2009，30（4）：96-98.

[17] 李晓芬，王炯，李乔丽，等.没食子酸清除DPPH 自由基的微量电化学滴定[J].云南民族大学学报：自然科学版，2012，21（4）：243-248.

[18] Ruiz E，Padilla E.Kaempferol inhibits apoptosis in vascular smooth music induced by a component of oxidized LDL[J].European Journal of Pharmacology, 2006(529):79-83.

[19] 董秀英，吕青涛，张国英等.DPPH法测定九州虫草不同极性部位抗氧化活性[J].中国实验方剂学杂志，2011，17（10）：70-73.

[20] Sharma O P，Bha T K.DPPH antioxidant assay revisited[J].Food Chemistry, 2009, 113( 4) : 1202-1205.

[21] 武汉大学.分析化学（第4版）[M].第4版.北京：高等教育出版社，2000：20-21.