抗氧化剂的超高效液相色谱-串联质谱法测定

唐丽娜，宁焕焱，曾宪远，罗运福，奉夏平*（广东省惠州市质量计量监督检测所，广东惠州516003）

抗氧化剂的超高效液相色谱-串联质谱法测定

唐丽娜，宁焕焱，曾宪远，罗运福，奉夏平*
（广东省惠州市质量计量监督检测所，广东惠州516003）

研究了油炸食品中化学合成酚类抗氧化剂--丁基羟基茴香醚（BHA）、二叔丁基对甲酚（BHT）、没食子酸丙酯（PG）、特丁基对苯二酚（TBHQ）的检测，采用超高效液相色谱-串联质谱法测定，以反相C18为分离柱，乙腈-甲醇水体系为流动相进行梯度洗脱，采用负离子检测模式，外标法定量。4种抗氧化剂呈良好线性关系（R2=0.995 3～0.999 8），PG方法检出限为2.0 μg/kg，BHA、TBHQ检出限为200 μg/kg，BHT检出限为500 μg/kg。回收率为79%～96%，相对标准偏差为0.9%～5.3%，方法准确、灵敏、重现性好，可用于油炸食品中抗氧化剂的检测。

超高效液相色谱-串联质谱法；抗氧化剂；检测；油炸食品

目前国际上开发的人工化学合成抗氧剂种类超过100种，但被各国认可，符合安全、高效的抗氧化剂只有十几种，合成抗氧化剂的优点抗氧化作用强、热稳定性好、抑菌及相对低廉的价格[1]。最常使用的合成抗氧化剂包括有：叔丁基对羟基茴香醚（butylatedhydroxyanisole，BHA）、2，6-二叔丁基对苯酚（butylated hydroxytoluene，BHT）、特丁基对苯二酚（tertbutylhydroquinone，TBHQ）、没食子酸丙酯（propyl gallate，PG）等，这四种抗氧化剂均为苯酚型结构化合物的酚类抗氧剂，能清除自由基、淬灭单线态氧、抑制氧化酶活性，阻断油脂自动氧化链式反应机制，所以具有很强的抗氧化性能，常单独或几种混合使用在食品中[2]。

油炸食品中含有许多不饱和脂肪酸，极易氧化或分解而变质，影响食品的风味、品质及营养价值，甚至产生对人体健康有害的物质[3]。向食品中加入符合我国食品安全法规定的抗氧化剂，可有效防止或延缓食品变质，保持营养风味。目前，各国对4种抗氧化剂的使用都有严格的限量规定，我国食品安全国家标准中也有明确的限定[4-5]。在许多情况下，这四种抗氧化剂经常复合使用，针对这种状况，有必要建立一种能同时准确测定多种抗氧化剂的快速分析方法，适应油炸食品中抗氧化剂的检验需求[6]。

抗氧化剂的检测方法有比色法、薄层色谱法[7]、气相色谱法（gas chromatography，GC）[8-9]、高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）[8，10]、气质联用法（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）[11-12]、液质联用法（liquid chromatography-mass spectrometer，LC-MS）等[13-15]，而超高效液相色谱-串联质谱法（ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UHPLCMS/MS）技术具有灵敏度高，选择性好，检测速度快的特点。本研究以油炸薯片、沙琪玛及方便面为研究对象，利用超高效液相色谱-串联质谱法对食品中4种酚类抗氧化剂进行了测定研究。该方法选择性高、灵敏、快速，10 min内可完成上机检测，满足同时测定油炸食品中多种抗氧化剂准确定量的要求，可为制定食品中多种抗氧化剂的检测标准提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

标准品没食子酸丙酯（propyl gallate，PG）、特丁基对苯二酚（tertiary butylhydroquinone，TBHQ）、丁基羟基茴香醚（butyl hydroxy anisd，BHA）、2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚（butylated hydroxytoluene，BHT）：德国Dr.Ehrenstorfer公司；甲醇、乙腈、正己烷均为色谱纯：美国Honeywell公司；甲酸、抗坏血酸及无水硫酸钠均为分析纯：济南盈动化工有限公司。

饱和正己烷：将正己烷和乙腈混合，在分液漏斗中充分振摇，使其相互饱和。静置分层，收集上层溶液，即为饱和正己烷。

0.1 %抗坏血酸乙腈-甲醇（4∶1，V/V）混合液：将正己烷和乙腈混合，在分液漏斗中充分振摇。静置分层后，收集下层溶液，加甲醇，且于每升溶液中溶解1 g抗坏血酸（ascorbic，ASA）。

检测样品油炸薯片、沙琪玛及方便面购自超市。

标准溶液的配制：分别准确称取4种抗氧化剂各10 mg于100 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，配制成100 mg/L标准储备液，置于4℃冰箱中保存。使用时根据需要储备溶液0.1%抗坏血酸混合液分别配制成合适浓度的系列混合标准工作液。

1.2 仪器与设备

岛津LC-30液相色谱仪：日本岛津公司；API-4000质谱仪：美国AB公司；Syncore平行蒸发仪：瑞士BUCHI公司；RE-6000旋转蒸发仪：上海荣亚生化仪器厂；MS-2旋涡混合器：德国IKA公司；Integral-3超纯水仪：美国Millipore公司；Toppette移液枪：上海恒奇仪器仪表有限公司。

1.3 方法

1.3.1 高效液相色谱条件

色谱柱：ZORBAX Extend C18柱（4.6 mm×150 mm× 2.1 μm）；流动相：乙腈（A），0.1%甲酸5 mmol/L乙酸铵甲醇水（20∶80，V/V）溶液（B），柱温为36℃；进样量为4 μL。梯度洗脱程序见表1。

表1 高效液相色谱梯度洗脱条件Table 1 Gradient elution condition of high performance liquid chromatography

1.3.2 质谱条件

电喷雾离子源（electrosprayionization，ESI）；检测方式：多反应监测（multiple reaction monitoring，MRM）；碰撞气（CAD）为0.02 MPa；气帘气（CUR）为0.08 MPa；雾化气（GS1）为0.17 MPa；辅助加热器（GS2）为0.19 MPa；喷雾电压（IS）为4 500 V；离子源温度为450℃。多反应监测各离子对及各优化参数见表2。

表2 抗氧化剂的LC-MS/MS质谱参数Table 2 LC-MS/MS parameters for antioxidants

1.3.3 样品处理方法

称取混合均匀的样品5.0g（精确至0.1mg），置于100mL玻璃比色管中，加入40 mL饱和正己烷振荡提取5 min，再加入20 mL含0.1%抗坏血酸乙腈-甲醇（4∶1，V/V）混合液涡旋振荡5 min，过滤后（用5 mL混合液洗涤滤纸2～3次）转移至分液漏斗中，静置分层，收集下层溶液；再加入20 mL乙腈-甲醇混合液，重复萃取两次，合并提取液于浓缩瓶中，用旋转蒸发仪浓缩至1 mL左右，最后将浓缩用抗坏血酸含0.1%的乙腈-甲醇混合液定容至5 mL，经0.20 μm滤膜过滤后作为待测液。

2 结果与分析

2.1 前处理方法的选择

分别用甲醇、乙醇、异丙醇和乙腈作为萃取溶剂，比较抗氧化剂的萃取效率。结果表明，甲醇和乙醇萃取出较多弱极性的杂质，对BHA和BHT的测定有干扰，需过柱。而异丙醇提取PG、BHT回收率不高，影响结果的准确性。采用乙腈作为提取溶剂时，杂质含量相对偏低，效果较好，用正己烷溶解油脂与分析靶标，降低溶液黏度，再用乙腈萃取，回收效果理想。另外在萃取时加入保护剂ASA，能促进氧化的微量金属离子钝化，从而降低抗氧化剂在提取和浓缩过程中被氧化的程度，保证方法的灵敏度、准确度与回收率。

2.2 色谱条件的选择

选用通用性强的SB-C18色谱柱对4种抗氧化剂进行分离。由于抗氧化剂大多数是极性比较强的酚类化合物，易分解，因而常出现色谱峰拖尾、鬼峰及不对称等现象。在流动相中加入适量的酸性抑制剂可抑制此类化合物的电离，改善峰形。实验发现，以乙腈-0.1%甲酸5 mmol/L乙酸铵甲醇水（20∶80，V/V）为流动相，4种抗氧化剂均得到很好的色谱峰以及较好的分离度。

2.3 质谱条件的优化

由于大多数抗氧化剂含有酚羟基，容易生成去质子化的分子离子，其生成正离子的丰度较小，灵敏度不及负电离模式，所以在实验中BHA、BHT、PG、TBHQ 4种抗氧化剂均选用ESI-电离模式。

采用蠕动泵进单标的方式确定两组反应监测（MRM）离子对，优化相应质谱参数，使靶标化合物的定性离子、定量离子产生的离子对强度比例大而稳定，选择响应值强、基质干扰小的子离子作为定量离子。

2.4 方法的线性范围与检出限

准确配制一系列浓度的混合标准工作溶液，按上述的仪器条件进行测定，以标准溶液的质量浓度（x）为横坐标，色谱峰面积（y）为纵坐标进行线性回归分析。以信噪比S/N=3、取样量5.0 g计算检出限。结果见表3。

由表3可知，4种抗氧化剂在一定质量浓度范围内呈良好线性关系，PG的检出限为2.0 μg/kg，TBHQ、BHA的检出限为200 μg/kg，而BHT的检出限相对较高，为500 μg/kg。

表4 样品加标回收率及相对标准偏差(n=6)Table 4 Recovery of standard addition and RSD of samples(n=6)

2.5 方法的精密度与回收率

准确称取油炸薯片、沙琪玛和方便面3种具有代表性且基体较复杂的样品各5.0g，分别添加1倍、2倍、5倍检出限的3个浓度水平进行加标回收实验，每个水平重复测定6次，计算方法的回收率和相对标准偏差（relative standard devi ation，RSD），结果见表4。由表4可知，4种抗氧化剂的回收率为79%～96%，相对标准偏差为0.9%～5.3%，表明方法准确可靠，精密度良好。加标样品的总离子流图见图1。

图1 加标样品的总离子流图Fig.1 Total ion chromatograms of adding standard samples

2.6 样品测定结果

采用本方法对油炸薯片、沙琪玛和方便面进行测定，其结果（表5）可知，样品中抗氧化剂往往都是以复合方式使用。食品安全国家标准GB 2760—2011《食品添加剂使用标准》中规定油炸食品、方便食品、糕点等食品中PG最大使用量为0.1 g/kg，TBHQ、BHA、BHT均为0.2 g/kg，而且各自用量占其最大使用量的比例之和≤1[5]。通过分析检测，在油炸薯片、沙琪玛、方便面中都有检测到不同浓度的抗氧化剂，其中BHA含量较高。但未超过国家标准所规定的最大使用限量。

表5 样品实际分析结果Table 5 Results of samples determination

3 结论

采用加入L-抗坏血酸（ASA）的饱和乙腈萃取的前处理方法，建立UPLC-MS/MS多反应监测模式分析检测食品中4种抗氧化剂的方法。该方法准确、灵敏、回收率高，回收率为79%～96%，RSD 0.9%～5.3%，而且10 min内完成分析检测，能有效的提高工作效率，可用于油炸食品、糕点、方便食品中酚类抗氧化剂的检测，适用范围广。

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Determination of antioxidants by UPLC-MS/MS

T ANG Lina,NING Huanyan,ZENG Xianyuan,LUO Yunfu,FENG Xiaping*
(Huizhou Quality and Measuring Supervision Testing Institute,Huizhou 516003,China)

A new method was established to detect four kinds of phenolic antioxidants in fried foods including BHA,BHT,PG,TBHQ by ultra performance liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry(UHPLC-MS/MS).The samples were detected by C18column by gradient elution using methanol-acetonitrile as mobile phase,and it was detected by negative ion detection mode and external standard method.The calibration curves of the four antioxidants were in good linear relationship(R2=0.995 3～0.999 8).The detection limit of PG,BHA,TBHQ and BHT were 2.0 μg/kg,200 μg/kg,200 μg/kg and 500 μg/kg,respectively,and the relative standard deviation was in the range of 0.9%～5.3%.The method was suitable for the analysis of four antioxidants mentioned above in fried foods with good accuracy and precision.

UPLC-MS/MS;antioxidant;detection;fried food

O657.7

A

0254-5071（2014）07-0098-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2014.07.022

2014-05-29

惠州市科技项目（2011B020006017）

唐丽娜（1975-），女，工程师，硕士，研究方向为分析化学。

*通讯作者：奉夏平（1975-），男，工程师，硕士，研究方向为分析化学。