不同荧光RT-PCR试剂盒检测H7亚型禽流感病毒的比较

（广州市动物疫病预防控制中心，广东广州 510440）

不同荧光RT-PCR试剂盒检测H7亚型禽流感病毒的比较

郑丽兰，张海明，张海冰，沈 丹，段晓冬

（广州市动物疫病预防控制中心，广东广州 510440）

[目的]比较评价4种H7亚型禽流感病毒荧光定量PCR试剂盒检测结果的差异。[方法] 同时用4种H7亚型禽流感病毒荧光定量PCR试剂盒对已知结果的抗原和145份家禽泄殖腔棉拭子进行检测，并对检测结果进行比较分析。[结果]WHO推荐的方法和厂家A的检测试剂盒的灵敏度最好，在将H7禽流感抗原稀释至1∶10-7时均能检测到禽流感病毒；而厂家B的试剂盒在抗原浓度1∶10-4以上时均能检测到禽流感病毒，但在1∶10-4至1∶10-7的稀释度则只能判定为可疑，需要进行重新检测；厂家C的H7亚型禽流感病毒检测试剂盒的灵敏度更差，只在抗原浓度1∶10-3以上时显示阳性，抗原浓度为1∶10-6和1∶10-7时均不能检测到H7亚型禽流感病毒。另外，4种试剂盒均表现出较好的特异性和重复性。[结论]不同厂家H7亚型禽流感病毒检测试剂盒的灵敏度等方面存在一定差异，WHO推荐的H7亚型禽流感病毒检测方法和厂家A的总体性能优于试剂盒B和C，适于临床检测与筛查。

禽流感病毒；H7亚型；荧光RT-PCR；比较

2013年2月以来，我国浙江、江苏、广东等十多个省份相继出现人感染H7N9亚型禽流感病毒的事件[1-2]，截止到2013年10月25日，已经造成137人感染，其中45人死亡[3-6]。该事件给我国养禽业造成了巨大的经济损失[7-9]。同年5月18日，我单位在日常例行监测工作中，在广州市增城某市场检测到H7N9亚型禽流感病毒，并及时采取相应的措施，为防止病毒扩散和预防我市市民感染H7N9亚型禽流感起到了十分重要的作用。众所周知，采取相应的措施控制疫情扩散的前提之一即为快速、准确地对疫情进行检测和确诊。由于H7N9亚型禽流感感染家禽后不表现明显的临床症状[10-11]，因此，利用实验室检测方法对其进行及时检测和确诊显得尤为重要，而荧光RT-PCR方法作为一项快速、高度敏感、高度特异和高通量检测新型检测技术已经广泛应用于包括H7N9禽流感病毒检测在内的动物疫病检测工作中，并成为多种病原检测的首选方法[12-13]。

目前，市场上针对H7亚型禽流感病毒的荧光RT-PCR检测试剂盒种类较多，但由于试剂盒生产企业的扩增目的片段不尽相同及其技术平台不同，不同试剂的敏感性、特异性和准确率等方面可能存在一定的差异，因此，为保证检测的准确性和疫情控制的及时性，本试验对目前市场上的几种主要的H7亚型禽流感荧光RT-PCR试剂盒进行比较，分析其检测的敏感性和特异性，为试剂盒的选择提供参考。

1 材料与方法

1.1 试剂

H7亚型禽流感病毒荧光RT-PCR检测试剂盒分别购自目前市场上较为常见的三家公司，分别命名为厂家A、厂家B和厂家C ；世界卫生组织（WHO）推荐的H7亚型引物和探针由英韦创津（上海）贸易有限公司合成，序列见表1； RNA提取试剂盒购自美国应用生物系统公司（美国ABI公司）。

表1 H7亚型禽流感病毒实时RT-PCR的引物和探针序列

1.2 主要仪器

AB I 7500实时荧光核酸扩增仪，Kingfsher Flex磁珠分选纯化仪。

1.3 阳性样品

H7亚型禽流感抗原（H7N9禽流感毒株，批号2013001）、H5亚型禽流感HA抗原和H9亚型禽流感检测阳性抗原购自哈尔滨兽医研究所（批号分别为2013002和2012002）；新城疫病毒HA抗原购自北京中海生物技术有限公司（批号为20130601）。

1.4 临床样品来源

145份家禽泄殖腔棉拭子源自本所2013年4～6月对广州市家禽交易市场例行监测的样品。

1.5 方法

1.5.1 核酸提取

严格按照试剂说明书进行操作：于试剂板样品孔中加入50 uL经充分振荡混悬的样品液体，随后每孔分别加入130 uL裂解液和20 uL磁珠Enhancer混合液（1∶1混合），再将所有试剂板置于Kingfsher Flex磁珠分选纯化仪进行核酸提取。阴、阳性样品操作同待检样品。

1.5.2 核酸检测和结果判定

WHO推荐的H7亚型禽流感病毒检测方法按WHO推荐的程序进行；其它三个不同厂家的检测试剂盒按说明书进行操作，并按照试剂盒说明书判定标准对结果进行判定。

1.5.3 灵敏性试验

将H7亚型禽流感抗原按10倍稀释成不同浓度（即7个滴度，分别为 1∶10、1∶100、1∶1000、1∶10000至1∶10-7），再用不同试剂盒同时进行检测以比较不同试剂盒的灵敏性。

1.5.4 特异性试验

分别对H5亚型禽流感HA抗原、新城疫病毒HA抗原和H9亚型禽流感检测HA抗原（各2个重复）进行核酸抽提，随后分别用上述4种H7亚型实时RT-PCR试剂盒进行检测。

1.5.5 重复性试验

对上述未稀释以及10倍稀释的H7亚型禽流感HA抗原进行核酸提取后，分别应用上述4种实时RT-PCR方法进行多次重复测定（n = 4），并通过统计学方法分析其重复性。

1.6 临床样品的检测

用上述4种检测试剂盒对临床采集的145份家禽泄殖腔棉拭子进行H7亚型禽流感病毒的检测，结果检出1份阳性和144份阴性，4种H7亚型荧光RT-PCR检测试剂盒检测结果一致。

1.7 统计学分析

试验所得数据运用SPSS 20统计软件进行分析。

2 结果

2.1 敏感性

以10倍梯度稀释的H7亚型禽流感抗原提取的RNA为模板，用四种荧光定量RT-PCR方法进行敏感性试验，并根据各自结果判定标准进行结果判定，发现WHO推荐的方法和厂家A的试剂盒检测均为阳性；而厂家B的试剂盒在10-4的稀释度以下均为阳性，而稀释度为10-5到10-7时均为可疑；用厂家C的试剂盒检测时，抗原稀释度在10-3以下时均为阳性，而在10-4和10-5时均为可疑，10-6和10-7时则均为阴性（表2）。对判定为可疑的样品，根据试剂盒说明书的要求进行了重复检测，结果均为阳性。

表2不同试剂盒灵敏性与结果判定比较

2.2 特异性

四种实时RT-PCR试剂盒均能检出H7亚型禽流感病毒，而对H5亚型禽流感HA抗原、新城疫病毒HA抗原和H9亚型禽流感均不能检测到任何荧光信号，说明这几种检测试剂盒特异性均较好。

2.3 重复性

重复试验结果表明，不同浓度参比样品进行了4次检测，4种荧光定量RT-PCR检测方法的变异系数均小于5%（表3），说明4种荧光定量PCR试剂盒都具有良好的结果重复性。

表3 4种实时RT-PCR方法的重复性比较

3 讨论

H7亚型禽流感病毒最先的报道是1902年的高致病性H7N7亚型禽流感病毒（A/Chicken/Brescia/1902（H7N7）），曾被认为是“鸡瘟（FEV）”[14]。近年来，全球范围内家禽中H7亚型禽流感已导致超过7000万家禽死亡，不仅波及美国、加拿大、智利等美洲国家，也波及巴基斯坦、德国、荷兰等亚欧国家，涉及H7N1、H7N3、H7N4、H7N7等低致病性毒株的多种亚型以及H7N1、H7N2、H7N3、H7N8 、H7N9等高致病性毒株的多种亚型[14]。2003年以前，人感染H7亚型禽流感的报道较少，且一般为实验室感染。2013年以前在人群中最大规模的暴发是在2003年的荷兰，该次H7N7亚型禽流感疫情共造成80余人感染，还导致了3000多万家禽死亡[15-16]。2013年3月，我国上海和安徽两地首先发现3例人感染新型重配H7N9亚型禽流感病毒的病例，在随后的几个月时间里，我国又有十多个省市陆续报道人感染和死亡，H7N9亚型禽流感不仅对公众健康的造成了巨大的威胁，也给我国养禽业带来了巨大的损失[9，17-18]。人感染H7N9禽流感事件发生后，病毒检测与分离、基因测序等工作迅速开展，特别是实时RT-PCR等快速检测方法的及时建立与应用，为动物卫生部门和卫生部门对H7N9亚型禽流感感染的及时确诊和有效处置提供了坚实的技术支持[19-20]。但是，随着商品化检测试剂的推出，在为检测工作带来便利的同时，由于不同厂家试剂盒的敏感性、特异性等有所差异，导致结果会有所偏差，有的甚至会漏检。因此需要对这些商品化试剂盒进行评估，以便为选择最合适的试剂盒以对H7N9亚型禽流感病毒的确诊提供技术依据。

本试验中所选的3个厂家的试剂盒是目前国内H7亚型禽流感检测常用的试剂盒，而WHO推荐的检测方法也是目前公认较为标准的H7禽流感检测方法。我们试验表明，WHO推荐的检测方法和3个厂家的试剂盒均具有较好的特异性和重复性，但是依据各自判定标准的灵敏性试验结果显示，4种检测方法之间差别较大：WHO推荐的方法和厂家A的检测试剂盒的灵敏度最好，在将H7禽流感抗原稀释至1∶10-7时均能检测到禽流感病毒；而厂家B的试剂盒在抗原浓度1∶10-4以上时均能检测到禽流感病毒，但在1∶10-4至1∶10-7的稀释度则只能判定为可疑，需要进行重新检测；厂家C的H7亚型禽流感病毒检测试剂盒灵敏度较差，只在抗原浓度1∶10-3以上时显示阳性，抗原浓度为1∶10-6和1∶10-7时均不能检测到H7亚型禽流感病毒。由于检测的灵敏度不高，当待检样品中病毒浓度不高时，使用厂家B的H7禽流感病毒检测试剂盒可能出现较多的“可疑”的检测结果，需要进行重复检测，这样不仅增加了检测成本和人力成本，更重要的是增加了检测所需要的时间，可能导致疫情诊断甚至处理的延误。而对于厂家C的H7禽流感病毒检测试剂盒，一旦样品中病毒含量较低时，很可能出现漏检的现象。

由于H7N9亚型禽流感病毒感染家禽后只表现轻微的临床症状甚至不表现症状，而该病毒又能引起重大的公共安全问题，因此对于该病毒的检测需要敏感性较高的试剂，以便避免可能的漏检给H7N9亚型禽流感的防控工作带来风险。鉴于此，我们认为WHO推荐的H7亚型禽流感病毒检测方法和厂家A的检测试剂盒试剂对于H7亚型禽流感病毒的快速检测更为合适。

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Comparison of different real-time RT-PCR kits for detection of H7 subtype avian infuenza virus

Zheng Lilan，Zhang Haiming，Zhang Haibing，Shen Dan，Duan Xiaodong

（Guangzhou Animal Disease Prevention and Control Center，Guangdong，Guangzhou，510440）

[Objective]To compare and evaluate the effcacy of the four real time RT- PCR diagnostic kits for H7 avian infuenza virus. [Methods]The H7 subtype antigen and 145 cloacal swabs of poultry with known results were detected by the four kits （the WHO recommended kit，Kit A，Kit B and Kit C） and their results were statistically analyzed.[Result]The WHO recommended method and Kit A had the highest sensitivity in detection of H7 virus with the dilution of 1∶10-7. The virus could be detected at the antigen concentration above 1∶10-4and 1∶10-3by Kit B and Kit C respectively. The virus could not be detected when the antigen dilution was 1∶10-6and 1∶10-7using Kit C showing the lowest sensitivity. However，all the four kits showed good specifcity and repeatability. [Conclusion]Different kits for H7 subtype avian infuenza virus had different performance of sensitivity. The overall performance of the WHO method and Kit A was better than the other two kits in screening and clinical surveillance.

avian infuenza virus；H7 subtype；real-time RT-PCR；comparison

S852.659.5；S859

：B

：1005-944X（2014）09-0073-04