贵州白香猪白细胞介素4全基因的克隆与序列分析

梁海英，曾智勇，王伟丞，汤德元，刘 钊

（贵州大学动物科学学院，贵州 贵阳 550025）

白细胞介素4(Interleukin-4，IL-4) 主要由活化的T细胞、单核细胞分泌产生的一种细胞因子，在调节T，B淋巴细胞的分化、活化，促进Th2细胞为特征的免疫应答中发挥重要作用[1]。有关IL-4研究较多，用于抗肿瘤、抗感染、抗炎症和作为新型的免疫增强剂，具有重要的临床应用价值[2-3]。自1982年由Howard等人首次发现IL-4以来，许多物种，如人、猪、牛、羊等的IL-4 cDNA相继被克隆成功，并对其分子结构和体内外生物学活性进行了研究[4-5]。

贵州白香猪是贵州省地方特色小型猪种，原产于贵州剑河县，具有体型小，基因纯合，肉质鲜美等特点[6-7]。发展贵州白香猪的饲养可有效地推动贵州地区的经济发展。目前国内外均未见有关贵州白香猪的IL-4基因及其免疫学特性的研究报道，本试验扩增并克隆其IL-4基因cDNA，旨在为深入了解IL-4在该类小型猪种免疫系统及免疫应答中的作用奠定基础，同时也为研制新型高效分子佐剂创造条件，对发展贵州白香猪特色养殖业具有一定意义。

1 材料与方法

1.1 供试动物、质粒及菌株

贵州白香猪，购自贵州大学香猪种猪场；pMD18-T Simple Vector购自大连宝生物公司；大肠杆菌感受态Top10菌株由本实验室制备保存。

1.2 主要试剂

人淋巴细胞分离液为中国医学科学院产品；胎牛血清、改良型RPMI-1640培养基购自HyClone公司；ConA购自Sigma公司；Trizol试剂购自invitrogen公 司；PrimeScript One Step RTPCR Kit Ver.2一步RT-PCR试剂盒、BamHⅠ和EcoRⅠ限制性内切酶、分子量标准物DL2000购自大连宝生物 公 司；E.Z.N.A.TM Gel Extraction Kit(50)胶回收试剂盒，OMEGA公司产品；普通质粒小提试剂盒为TIANGEN公司产品；其他化学试剂均为国产分析纯。

1.3 引物的设计与合成

参照GenBank中猪白介素4基因序列（登录号为NM _214123），应用Primer Premier 6.0 软件设计如下克隆引物：

IL-4-S：5-CGGGATCCTTCAT GGGTCTCACCTC-3；

IL-4-As：5-CGGAATTCTCAG CTTCAACACTTTGA -3。

为了便于克隆，分别在其两端引入BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点（划线部分）预期扩增大小为427 bp。引物由大连宝生物公司合成。

1.4 猪淋巴细胞的分离与培养

无菌采取健康贵州白香猪前腔静脉血20 mL，用3.8%柠檬酸钠抗凝；加入等量的D-Hank，s液稀释混匀；取稀释的外周血缓慢加入等量的淋巴细胞分离液上；室温2 000r/min离心20 min；小心吸取雾状层，加入D-Hank，s液洗涤，室温2 000 r/min离心10 min洗涤3次，弃上清；沉淀细胞用含有10%胎牛血清的RPMI1640培养液（含青、链霉素各100 μg/mL）悬浮；加入刀豆蛋白ConA 至终浓度为10 μg/mL诱导刺激，在37 ℃、5% CO2条件下培养48 h。

1.5 淋巴细胞总RNA的提取

收集诱导48 h的淋巴细胞于15 mL离心管中，室温2 000 r/min离心10 min，弃上清；向沉淀中加入1 mL Trizol，涡旋振荡器剧烈振荡以裂解细胞，将裂解液转入一新的Ep管中，室温放置5 min；加入氯仿200 μL，用力振荡15 s，室温静置3 min，4 ℃12 000 r/min离心15 min；小心吸取上层水相，加入500 μL异丙醇，充分混匀后于-20 ℃静置20 min，4 ℃ 12 000 r/min离心10 min，弃上清，加入1 mL 75%乙醇涡旋混匀洗涤沉淀，4 ℃12 000 r/min离心10 min；弃上清，沉淀于室温自然干燥，加入20 μL DEPC处理水溶解RNA，分装后于-80 ℃保存备用。

1.6 IL-4基因RT-PCR扩增

图1 IL-4基因的RT-PCR鉴定结果

图2 质粒pMD18-IL-4质粒的PCR和双酶切鉴定结果

参照一步RT-PCR试剂盒说明，RT-PCR反 应 体 系：2×1 Step Buffer 25 μL, 总 RNA 5 μL, PrimeScript 1 Step Enzyme Mix 2 μL, 上下游引物各2.5 μL，RNase Free H2O 0.5 μL。 按以下条件进行反应：50 ℃ 40 min；94 ℃5 min ；94 ℃ 30 s，59 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35cycle；72 ℃ 10 min。

图3 pIL-4基因推导的氨基酸序列的一致性分析

扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.7 IL-4基因的克隆与鉴定

将经回收纯化的RT-PCR产物与pMD18-T Simple载体按常规方法进行连接并转化感受态细胞Top10。挑取白色菌落进行增菌培养，小剂量试剂盒提取质粒DNA，将经PCR及酶切鉴定的克隆质粒送至大连宝生物公司测序，并命名为pMD18-IL-4。

1.8 序列分析

应 用DNAStar 7.0和MEGA5.0生物学软件对贵州白香猪IL-4基因的测序结果进行分析，并与目前Genebank中已发表的其他IL-4基因序列进行同源性分析并绘制IL-4基因遗传进化树。猪源参考序 列 ：AF493991(Chenghua pig，China)，HQ236500（Guangxi Bama pig, China），L12991（Sus scrofa），N M 2 1 4 1 2 3(L a r g e W h i t e)，X68330(Large white，England)。不同物种IL-4的参考序列：AF239917（Dog，狗），AM937235(Homo sapiens，智人)，M13982（Human，人），JQ432546（Horse，马），M25892(Mus musculus，鼠 )，M77120(Bovine，牛 )，NM_001009313(Ovis aries ，绵羊)，U39634(Catus，猫)，XM_005024359(Anas platyrhynchos，鸭 )。

2 结果

2.1 目的基因的扩增

图4 猪源IL-4基因推导的氨基酸序列的遗传进化树 图5 不同种属动物IL-4基因推导的氨基酸序列的遗传进化树

以总RNA为模板，扩增出一条与预期片段大小427 bp相符的特异性条带（图1）。

2.2 重组克隆质粒的鉴定

将纯化的IL-4基因RT-PCR产物连接至pMD18-T载体，提取质粒，PCR及酶切鉴定结果均可见目的条带，表明已成功构建重组克隆质粒pMD18-IL-4（图 2）

2.3 重组质粒pMD18-IL-4的测序结果

挑取已鉴定的阳性克隆质粒，送大连宝生物公司测序，结果表明IL-4基因已成功克隆至 pMD18-T Simple载体，其ORF长为402 bp，编码133个氨基酸，该序列已收录入GenBank，登录号为JF906512。通过信号肽序列的Signal4.0在线分析结果表明，贵州白香猪IL-4 ORF编码的氨基酸序列中前24个氨基酸为信号肽序列，成熟肽由后面109个氨基酸构成。N-糖基化位点的NetNGlyc1.0在线分析表明，该推导氨基酸序列有3个潜在的N-糖基化位点，分别位于第62～64位、96～98位和102～104位氨基酸处。

2.4 IL-4基因的氨基酸一致性分析

贵州白香猪IL-4基因序列与Genbank中其他IL-4基因氨基酸一致性分析结果（图3）表明：贵州白香 猪 与 AF493991（99.4%），L12991（98.1%）氨基酸一致性相对较低外，与其他猪源IL-4基因氨基酸一致性均为100%。与其他种属动物的IL-4基因氨基酸的一致性则较低，为 37.2%～82.7%，其中与牛（M77120)最高，为82.7%，其余依次绵羊(NM_001009313)80.8%、狗（AF239917）76.9%、 猫 (U39634) 和 马（JQ432546）74.4%、 智 人 (AM937235)60.9%、 人（M13982）55.9%、 鼠（M25892)44.9%，与鸭(XM_005024359)最低，为37.2%。

2.5 IL-4基因的遗传进化树

应用MEGA5.0软件，分别将Genebank中已发表的IL-4序列按猪源、猪与其他种属动物进行比较、绘制遗传进化树，结果如图4、图5。从猪源IL-4基因的遗传进化树中，可知除贵州白香猪与L12991的IL-4遗传距离稍远位于不同的进化分支外，与其余猪源IL-4基因均位于同一进化分支，彼此亲缘关系较近。此外，贵州白香猪IL-4基因遗传距离与牛、羊、狗的亲缘关系较近，而与鼠和鸭的亲缘关系较远，表明IL-4存在明显种属差异性。

3 讨论

细胞因子作为免疫增强剂的研究已成为免疫佐剂研究的一个新方向。IL-4是机体体液免疫的重要调节因子，对免疫应答的影响主要是抑制细胞免疫，促进体液免疫(特别是IgE反应)，增强特异性和非特异性的杀伤功能[8]。IL-4在免疫方面的调节功能，有利于新型疫苗佐剂的研究和病毒性疫病的防治。序列分析结果表明，猪源IL-4基因在进化中较为保守，彼此亲缘关系较近，具有明显的同源性，表明猪种的不同不会使IL-4出现明显差异，同一物种IL-4基因具有极高的保守性。与其他物种的IL-4相比，猪IL-4基因与家畜如牛、羊、马遗传距离较近；而与鼠，鸭的遗传距离较远，表明IL-4存在种属差异性。

试验首次扩增克隆了贵州白香猪IL-4基因，这为进一步研究贵州白香猪IL-4在体内外的作用，并为研究其生理活性及在疾病和疫苗免疫中的作用提供了条件。同时贵州白香猪IL-的深入研究，也可以为猪源器官移植供体的研究提供参考。

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