缬沙坦对人冠脉内皮细胞氧化应激过程中gp91Phox的影响

王 成，韩卫星，吴继军，刘 超，刘晓颖

缬沙坦对人冠脉内皮细胞氧化应激过程中gp91Phox的影响

王 成1，2，韩卫星1，吴继军1，刘 超3，刘晓颖4

目的研究缬沙坦对人冠脉内皮细胞（HCAEC）氧化应激过程中gp91Phox的影响。方法对照组：体外贴壁培养HCAEC，不进行其他干预；实验组：相同培养条件下加入缬沙坦（10 μmol／L）培养24 h。应用Western blot法和细胞免疫荧光法测定两组细胞中gp91Phox的水平，对两组结果进行统计分析并比较。结果实验组HCAEC中gp91Phox的水平明显低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.01）。结论缬沙坦可以显著减少HCAEC中尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）氧化酶亚基gp91Phox的表达，从而降低氧化应激水平。

缬沙坦；人冠脉内皮细胞；氧化应激；gp91Phox

氧化应激是指机体内产生活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS）系统的氧化作用水平与具有阻止其效应、修复其损害的抗氧化系统的抗氧化作用水平失衡。体内的ROS产生过多或机体的抗氧化能力减低，致使ROS清除不完全，而在机体内聚积，产生氧化性损伤［1－2］。尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）氧化酶是体内产生ROS的重要酶之一，是由细胞膜亚基gp91Phox、p22Phox，细胞浆亚基p40Phox、p47Phox、p67Phox以及小分子的GTP酶结合蛋白Rac组成的复合体［3］。血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂（angiotensin receptor blocker，ARB）成为目前临床治疗心血管系统疾病的常用药，可干扰NADPH氧化酶以降低氧化应激水平。针对NADPH氧化酶所采用的抗氧化治疗可能成为今后预防和治疗与氧化应激有关疾病的作用靶点［4］，从而也为心血管疾病的临床抗氧化治疗提供一个新途径。然而ARB类药物如何通过NADPH氧化酶来降低氧化应激水平的具体途径和机制尚不明确。该研究旨在探讨ARB类药物缬沙坦对人冠脉内皮细胞（human coronary artery endothelial cell，HCAEC）氧化应激过程中NADPH氧化酶亚基gp91Phox的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞株 HCAEC购自上海拜力生物科技有限公司。

1.1.2 主要试剂 DMEM培养基购自美国Gibco公司；胎牛血清购自杭州四季青公司；缬沙坦购自美国Sigma公司；小鼠抗人多克隆抗体gp91Phox购自美国Santa Cruz公司；小鼠抗人单克隆抗体β-actin、TRITC标记山羊抗小鼠IgG和辣根酶标记山羊抗小鼠IgG均购自北京中杉金桥生物技术有限公司；BCA试剂盒和ECL发光试剂盒均购自美国Pierce公司；蛋白Marker购自北京全式金公司；DAPI购自美国Invitrogen公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞复苏、培养和传代 细胞复苏、培养和传代按常规方法操作。细胞以105密度传代，传代细胞随机分两组：一组作为对照组，对照组细胞常规培养，不做任何处理；另一组作为实验组，实验组在细胞传代2 h后，细胞基本贴壁时，加入缬沙坦（10 μmol／L）并记时，待处理24 h后，取出两组培养的细胞备用。

1.2.2 蛋白样品的提取 分别取出上述两组细胞置于冰上，吸出培养液，用预冷的PBS液洗3次，再加1 ml预冷PBS吹打贴壁细胞，收集实验组和对照组的细胞于EP管中，4℃离心2 min（4 000 r／min），分别加入预冷细胞裂解液，在冰水中超声裂解细胞15 s，4℃离心10 min（4 000 r／min），分别收集上清液于新EP管中，4℃离心20 min（14 000 r／min），此时上清液即为细胞质蛋白成分，沉淀部分用分析液溶解即为细胞膜蛋白成分。提取的细胞质和细胞膜蛋白，并用BCA试剂盒进行定量，加入上样缓冲液，放入煮沸的水浴锅内加热5 min，－20℃保存备用。

1.2.3 Western blot法测定细胞中gp91Phox的水平

取出上述的蛋白样品，行SDS-PAGE电泳分离蛋白质，5%浓缩胶以80 V电压电泳约30 min，12%分离胶以100 V电压电泳约120 min。完成后取出凝胶，以80 V电压转膜约60 min，将蛋白转到PVDF膜上。取出PVDF膜，以5%脱脂奶溶液封闭2 h，再加小鼠抗人gp91PhoxIgG（1∶500）于4℃孵育过夜。以TBST洗膜3次，每次10 min，洗涤后加辣根酶标记山羊抗小鼠IgG（1∶5 000），室温孵育2 h，同时以β-actin（1∶1 000）作为内参，最后用ECL发光试剂盒检测，压片曝光显影。

1.2.4 细胞免疫荧光法测定细胞中gp91Phox的水平

细胞免疫荧光片的制作，常规传代培养细胞，放入用多聚赖氨酸预处理的盖玻片，2 h后待细胞基本贴壁时，实验组加入缬沙坦（10 μmol／L），对照组不做任何处理，待24 h后取出盖玻片，用PBS溶液洗3次，每次5 min，－20℃预冷的甲醛固定2 min，弃甲醛，70%乙醇室温固定5 min，弃乙醇，PBS溶液洗3次，每次5 min。1%脱脂奶溶液封闭30 min，再加小鼠抗人gp91PhoxIgG（1∶100）室温孵育2 h。以封闭液洗洗3次，每次5 min，再以TRITC标记山羊抗小鼠IgG（1∶200）作为二抗，室温孵育1 h，PBS溶液洗3次，每次5 min，以0.5 μg／ml DAPI溶液100 μl覆盖盖玻片，室温3 min，PBS溶液洗3次，每次5 min，用荧光封片胶封片，4℃避光储存，隔夜后于荧光显微镜下拍照。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 Western blot法检测缬沙坦对HCAEC中gp91Phox表达水平的影响与对照组比较，实验组在HCAEC中gp91Phox表达水平明显降低，差异有统计学意义（P＜0.01），见图1。

2.2 细胞免疫荧光法观察缬沙坦对HCAEC中gp91Phox表达水平的影响采用细胞免疫荧光方法观察结果如下：与对照组比较，实验组在HCAEC中gp91Phox表达水平显著降低，见图2。

图2 荧光显微镜观察缬沙坦对HCAEC中gp91Phox蛋白表达的影响 ×1 000A、B、C：对照组；D、E、F：实验组；1：DAPI染色示细胞核；2：TRITC标记gp91Phox蛋白；3：MERGE为相应组1和2两个图像的叠加

3 讨论

冠心病已成为目前心血管疾病中导致猝死的主要原因之一，其发病原因已经不能完全用那些传统危险因素加以解释，如吸烟、糖尿病、高血压和高血脂等。氧化应激作为一个新的角色，在冠心病的发生发展过程中起了重要的作用。氧化应激时机体内各种有害刺激导致ROS的产生，而抗氧化防御与其严重失衡，致使ROS积蓄，从而引起细胞毒性反应和组织损伤［5］。当ROS生成过多而抗氧化酶活性不足时，就会引起蛋白质、脂质以及核酸等的氧化性损伤，造成细胞生物学功能发生障碍，从而引起相关疾病发生、发展［6］。

氧化应激在动脉粥样硬化发生、发展的众多危险因素以及分子水平损伤机制里都有其参与［7］。研究［8］表明ROS不仅存在于动脉粥样硬化的发病机制，而且病程进展中也一直有ROS的存在。冠状动脉斑块的形成以及破裂与ROS的氧化性损伤作用有关，其可以作用于血管内皮细胞和血管平滑肌细胞，从而引起多种细胞因子产生及活化，导致内皮细胞发生凋亡以及血管平滑肌细胞产生迁移，最终引起冠状动脉内斑块的形成以及破裂。Honjo et al［9］研究发现，在冠状动脉粥样硬化患者的冠脉中NADPH氧化酶的表达显著增强，并且脉管中被氧化的低密度脂蛋白的分布也与NADPH氧化酶以及ROS有着密切的联系，氧化型低密度脂蛋白是导致内皮细胞损伤以及诱导内皮细胞内促炎症因子表达的重要原因，脉管中的NADPH氧化酶、ROS以及低密度脂蛋白形成了一个恶性循环。

动脉粥样硬化是冠心病发病的基础，而动脉粥样硬化是一种由于氧化应激引起和放大的血管壁的炎性反应，而ARB类药物可以降低氧化应激水平［10］。内皮功能障碍是动脉粥样硬化发生的第一步，肾素－血管紧张素系统在发展内皮功能障碍和动脉粥样硬化中扮演重要的角色，许多临床试验［11］显示ARB类药物能减少心血管疾病的发生，表明ARB类药物能预防和延迟动脉粥样硬化。临床中运用ARB类与他汀类药物联合用药治疗心血管系统疾病，可以更好的降低组织的氧化应激水平，比两者单独使用更加有效［12］。氧化应激在众多的心血管疾病尤其是在冠心病的发生发展中有着重要的作用，传统治疗方法疗效始终有限，而介入支架治疗创伤性较大且治标不治本，容易二次堵塞，因此在传统治疗方法上联合抗氧化治疗已成为一种趋势，而ARB类药物也成为目前临床首选的抗氧化治疗药物之一。虽然目前临床抗氧化治疗冠心病尚未取得预期的疗效，但随着对氧化应激研究的不断深入，新型抗氧化剂的发现，冠心病的治疗定会取得满意疗效。

鉴于ARB类药物对NADPH氧化酶的影响，本实验研究了ARB类药物对NADPH氧化酶亚基gp91Phox的影响，并表明缬沙坦可以抑制HCAEC的NADPH氧化酶亚基gp91Phox的表达，缬沙坦可以抑制血管的氧化应激反应，提示可能是ARB类药物能够降低氧化应激水平的机制之一；同时，也说明缬沙坦对冠状动脉氧化应激状态有抑制作用，应该对冠心病的防治有益。但ARB类药物对NADPH氧化酶的其他亚基影响及作用机制，将是本实验室接下来需要研究的。

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Effect on gp91Phoxhuman coronary artery endothelial cells in the process of oxidative stress by valsartan

Wang Cheng1，2，Han Weixing1，Wu Jijun1，et al
（1Dept of Cardiology，The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230022；2Dept of Diagnostics，The First Clinical College of Anhui Medical University，Hefei 230032）

ObjectiveTo study the effect on human coronary artery endothelial cells（HCAEC）gp91Phoxin the process of oxidative stress by valsartan.MethodsThe control group：adherent culture HCAEC in vitro，no other intervention；the experimental group：under the same conditions with valsartan（10 μmol／L）train for 24 hours.U-sing Western blot and cell immunofluorescence measure gp91Phoxlevels in two groups of cells.The results were statistically analyzed and compared in both groups.ResultsThe experimental group gp91Phoxlevel significantly lower than the control group in HCAEC（P＜0.01），the difference was statistically significant.ConclusionValsartan can significantly decrease the nicotinamide adenine dinucleotide phosphate（NADPH）oxidase subunit gp91Phoxexpression in HCAEC，thus reduce oxidative stress level.

valsartan；HCAEC；oxidative stress；gp91Phox

R 541.4；R 972＋.4

A

1000－1492（2014）06－0739－04

2014－02－17接收

国家自然科学基金（编号：81070210）

1安徽医科大学第一附属医院心血管内科，合肥 230022安徽医科大学2第一临床学院诊断学教研室、3基础医学院组织与胚胎学教研室、4生命科学院细胞生物学教研室，合肥 230032

王 成，男，硕士研究生；韩卫星，女，教授，主任医师，博士生导师，责任作者，E-mail：ayhwx57＠163.com