牛蒡子苷元对小鼠脾细胞增殖的影响及相关机制

陆 明，姬飞虹，张林杰

牛蒡子在中国传统中药中具有抗炎利尿排毒的作用［1］，而其单一化合物提取物牛蒡子苷(arctiin，AC)或牛蒡子苷元(Arctigenin，ATG，图1)亦具有免疫抑制功能和抑癌功能［2－3］，但ATG的免疫抑制机制尚不明确。mTOR作为一种保守的丝/苏氨酸激酶，可以促进细胞蛋白质的翻译并促进细胞从G1期进入S期，与细胞增殖、生存和代谢密切相关，并参与了免疫细胞激活和增殖［4－5］。该研究通过观察ATG对小鼠原代脾细胞的作用，检测mTOR通路的相关改变，探索ATG的免疫抑制机制。

1 材料与方法

图1 Arctigenin结构

1.1 材料 ATG购于上海源叶生物;雷帕霉素(rapamycin，RAPA)购于上海生工;BALB/c小鼠购于上海斯莱克实验动物有限公司;PRMI 1640细胞培养基购于美国Gibco公司;青霉素、链霉素、吐温20、完全蛋白酶抑制剂、细胞裂解液、丽春红、二甲基亚砜(DMSO)均购于美国 Sigma－Aldrich公司;ELISA试剂盒购于上海依科赛公司;BCA蛋白定量试剂盒购于美国Thermo公司;GAPDH抗体购于华安生物公司;AMPK、p－AMPK、Raptor、p－Raptor、mTOR、p－mTOR、P70S6K、p－P70S6K、Akt、p－Akt抗体均购于美国 Cell Signaling Technology公司;蛋白预染Marker、一抗稀释液、辣根过氧化物酶标记的二抗、ECL化学发光液购于碧云天公司;硝酸纤维素膜购于美国Millipores公司。

1.2 方法

1.2.1 BALB/c小鼠脾细胞原代培养 配制含10%胎牛血清、110 mg丙酮酸钠、20 mmol/L HEPES、100 U/ml青霉素、0.1 mg/ml链霉素的 1 L PRMI 1640培养液(pH 7.2)。处死6～8周小鼠取脾脏，置于冷PBS中，研磨，过200目筛网，1 200 r/min离心5 min，去上清液，沉淀加入红裂液1 ml/脾，混匀，静置1 min，加入PBS离心，再加入PBS，过膜，1 200 r/min离心5 min，所剩细胞洗涤1～2次，1 ml 1640打散离心后的沉淀(10 μl细胞悬液+190 μl台盼蓝，取10 μl计数)。

1.2.2 MTT测ATG的细胞毒性 用RPMI 1640将小鼠原代脾细胞调成4×106个/ml，在96孔板中，每孔加 100 μl细胞悬液(4 ×105个细胞)，50 μl培养液和 50 μl ATG(终浓度为 200、100、50、25、12.5、6.25 μmol/L，RPMI 1640 溶解，对照组为培养液)，各浓度设3个复孔，另设置3个不加细胞和药物(用培养基替代)的调零孔，37℃、5%CO2孵箱中培养48 h，培养结束前4 h 加20 μl MTT(母液5 mg/ml)，培养结束后加入MTT三联溶解液，4 h后测OD 570 nm处波长。结果用GraphPad Prism 5软件作图，用SPSS 21.0软件计算半数细胞毒性浓度(50%cytotoxic concentration，CC50)。

1.2.3 H3－胸腺嘧啶核苷掺入法测ATG的增殖抑制作用 于96孔板中每孔加入100 μl细胞悬液(4×105个细胞)，50 μl ATG(终浓度为50、25、12.5、6.25、3.125、1.562 5 μmol/L，RPMI 1640 溶解，对照组加培养液)和50 μl刀豆蛋白 A(concanavalin，ConA，终浓度20 μg/ml)，总体积200 μl。每组设5 个复孔，另设5孔不加ConA作为细胞增殖的本底对照，37℃、5%CO2孵箱中培养48 h，结束培养前8 h每孔加入H3－TdR 25 μl。培养结束时，先在HARVEST上收集细胞。再在液闪机(beta－counter)上检测。结果用GraphPad Prism 5软件作图、进行与对照组相比的单因素方差分析，用SPSS 21.0软件计算半数细胞抑制浓度(50%inhibitory concentration，IC50)。

1.2.4 ELISA法测定细胞培养上清液中白介素2(IL－2)、干扰素 γ(IFN－γ)含量 用 RPMI 1640 将小鼠原代脾细胞调成7.5×106个/ml，于24孔板中每孔加400 μl细胞悬液(3 ×106个细胞)，200 μl ConA(终浓度 20 μg/ml)和 200 μl ATG(终浓度为 25、12.5、6.25 μmol/L，对照组加培养液)，37 ℃、5%CO2孵箱中培养24 h，离心1 770 r/min，5 min收集上清液，测定细胞因子。根据依科赛细胞上清液IL－2、IFN－γ测定试剂盒指示进行测量。每次测量样品，设置3个复孔。结果用GraphPad Prism 5软件作图，SPSS 21.0软件进行与对照组相比的单因素方差分析。

1.2.5 Western blot法检测mTOR通路相关蛋白用RPMI 1640将小鼠原代脾细胞调成1.2×107个/ml，于6孔板中每孔加1 ml细胞悬液(1.2×107个细胞)，500 μl ConA(终浓度 20 μg/ml，空白组加培养基)和 500 μl ATG(终浓度为 25、12.5、6.25 μmol/L，对照组加培养基，阳性对照组用终浓度50 μmol/L RAPA替代)，37℃、5%CO2孵箱中培养24 h。使用RIPA细胞裂解液提取蛋白，BCA蛋白分析试剂盒(Thermo)进行蛋白定量，配置统一浓度(1 μg/μl)蛋白溶液。配置SDS－PAGE胶(5%浓缩胶、6%或10%分离胶)，每孔 30 μl，电泳，转膜，5%脱脂牛奶封闭1 h，按说明书比例(1∶1 000)加入一抗室温孵育1 h，4℃过夜，TBST洗10 min×3次，加辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗(1∶500)，室温孵育2 h，TBST洗10 min×3次，ECL显色，X线片暗室曝光15 min，X线片显影定影。结果用Image J软件进行灰度定量，用GraphPad Prism 5软件进行作图和与对照组的单因素方差分析。

1.3 统计学处理 采用SPSS 21.0和GraphPad Prism软件进行分析(图中的误差棒均为标准差SD，均来自三次独立实验的统计结果)和作图，数据用±s表示。实验组与对照组之间均数比较采用单因素方差分析。

2 结果

2.1 ATG对小鼠原代脾细胞的作用 通过MTT测得ATG在6.25～200 μmol/L之间对小鼠脾细胞活性的影响见图2。ATG对小鼠脾细胞毒性的CC50为(4 237.23±1 670.86)μmol/L，表明ATG对小鼠脾细胞无明显细胞毒性。

图2 ATG对小鼠脾细胞的毒性作用

2.2 ATG对ConA诱导小鼠脾细胞增殖抑制作用及IC50测定 通过H3－胸腺嘧啶核苷掺入法实验测得ATG在3.125～50 μmol/L浓度时显著抑制ConA诱导的小鼠脾细胞增殖(P＜0.01，F=97.38)，见图3;并计算出ATG抑制ConA诱导小鼠脾细胞增殖的IC50为(15.55±6.13)μmol/L。

图3 ATG对ConA刺激的小鼠脾细胞的抑制效应

2.3 ATG对原代培养的小鼠脾细胞 IFN-γ、IL-2分泌的影响 通过ELISA测得ATG在6.25～25 μmol/L浓度时小鼠脾细胞上清液中 IFN－γ(P＜0.01，F=67.31)和 IL－2(P ＜0.01，F=38.99)的含量显著下降，见图4。

2.4 ATG对mTOR途径中相应蛋白磷酸化的影响 在给药24 h之后，与对照组进行比较，ATG显著抑制了小鼠脾细胞mTOR(P＜0.01，F=31.26)及下游P70S6K的磷酸化(P＜0.01，F=45.70)，并且在上游激活了AMPK的磷酸化(P＜0.01，F=11.15)，提高了Raptor的磷酸化水平(P＜0.01，F=20.39)，而相应非磷酸化蛋白的水平没有明显改变。同时ATG没有明显改变其上游Akt的磷酸化水平。见图5。

3 讨论

免疫细胞的过分激活和增殖常导致自身免疫反应和移植排斥反应等严重免疫疾病。本研究显示随着ATG浓度的增高，小鼠原代培养脾细胞的增殖水平明显地降低，在15.55 μmol/L时，其增殖水平可降低50%。而细胞毒性实验则表明这种抑制并不是由ATG的毒性导致的，提示可能由于ATG作用于细胞中某些与细胞增殖相关的信号通路，从而导致了细胞增殖抑制。

用ConA刺激小鼠原代培养的脾细胞主要激活T细胞的增殖，IFN－γ、IL－2作为 T细胞释放的主要炎性因子，在免疫细胞群整体的激活增生和募集中有重要的作用［6］。本研究显示随着ATG给药浓度的增高，小鼠脾细胞上清液中IFN－γ、IL－2的含量明显降低，一方面提示T细胞分泌淋巴因子的能力减低，一方面提示小鼠脾淋巴细胞的激活和增殖受到了抑制。

RAPA是mTOR的特异性抑制剂，具有免疫抑制作用，其衍生物(rapalog)广泛应用于临床的免疫抑制治疗，本研究使用RAPA作为mTOR受抑制的阳性对照［7］。当mTOR被抑制时，其下游的P70S6K也被抑制，进而抑制蛋白质的合成以及细胞的增殖和活性［8］。本研究显示ATG显著降低了小鼠原代脾细胞中mTOR和P70S6K的磷酸化水平，提示ATG可能通过减少细胞周期素、淋巴因子等的蛋白合成，进而导致细胞增殖抑制。

Akt和 AMPK是 mTOR的上游蛋白，作为mTOR上游的细胞因子和能量感受器，其激活分别促进和抑制了 mTOR的磷酸化激活［9－10］。其中AMPK可以通过TSC1/2/RHEB途径抑制mTOR的磷酸化，也可以直接磷酸化Raptor而降低mTOR的活性［4］。本研究显示mTOR上游的AMPK蛋白随ATG浓度升高发生显著的磷酸化激活，AMPK下游的Raptor的磷酸化也相应增强;但Akt蛋白的改变并不显著，提示ATG对小鼠原代脾细胞mTOR通路的抑制可能是通过AMPK的激活实现的。

综上所述，ATG通过促进AMPK和Raptor的磷酸化，抑制了mTOR/P70S6K的活性，并抑制了淋巴因子IL－2、IFN－γ的分泌和小鼠原代脾细胞的增殖，为进一步深入研究ATG的免疫抑制作用和相关机制提供了研究基础。

图4 ATG对ConA刺激的小鼠脾细胞培养上清液中IFN-γ、IL-2含量的影响

图5 ATG对mTOR途径中相应蛋白磷酸化的影响

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