乳源抗菌－免疫调节融合肽对卵巢癌细胞增殖、凋亡的影响

唐宜桂，李小勤，刘 琛，雷 婷，秦宜德

牛乳铁蛋白肽(bovine lactoferricin，LfcinB)来源于牛乳铁蛋白N端的25个氨基酸残基，是一种具有抗菌活性的生物活性肽［1］。乳源免疫调节肽是源于牛乳β-酪蛋白第63～68氨基酸残基上的短肽，其氨基酸序列为PGPIPN，具有抑制肿瘤生长等活性［2－4］。乳源抗菌 －免疫调节融合肽(antibacterial-immunomodulating fusion peptide，AIFP)是通过柔性连接臂将上述两种小分子肽连接形成的融合多肽。该实验室的前期研究［3－4］显示，卵巢癌细胞株转染了该融合肽基因能明显抑制肿瘤细胞生长。该研究将探讨AIFP直接作用于卵巢癌细胞，分析其对卵巢癌细胞增殖的影响及其可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 细胞株、卵巢癌临床原代细胞 卵巢癌细胞株

SKOV3由本实验室保存。卵巢癌样本取自安徽医科大学第一附属医院妇产科手术室，由本实验室进行原代培养。

1.2 药物与试剂 AIFP(上海生工生物工程有限公司合成)，纯度＞99.8%;紫杉醇购自深圳万乐药业;胰岛素样生长因子(insulin-like growth factor，IGF)、表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)、β-雌二醇(β-Estradiol)购自美国 Peprotech公司;MTT、1640培养基和DMEM培养基购自美国Gibco公司;胎牛血清购自浙江天杭生物科技有限公司;Ⅰ型、Ⅱ型胶原蛋白酶购自美国Life公司;RT-PCR试剂盒购自美国Fermentas公司。

1.3 方法

1.3.1 细胞培养 人卵巢癌细胞株SKOV3培养在含10%胎牛血清RPMI-1640培养基(含100 μg/ml青霉素和100 μg/ml链霉素)中，在37℃、5%CO2的细胞培养箱中培养，用0.25%胰蛋白酶消化传代，取对数生长期的细胞进行试验。从无菌临床手术室取人卵巢癌组织块，放于预先准备的无菌的盛有PBS缓冲液的培养瓶中，在无菌环境中用PBS缓冲液冲洗癌组织块，然后用无菌眼科剪剪成1 mm3左右的小块，放入无菌15 ml离心管中，用0.05%的Ⅰ型胶原酶在37℃消化20～30 min后，取上层细胞悬液，800 r/min离心10 min，收集细胞计数，配制成105个/ml的细胞悬液，并用台盼蓝对细胞活力进行检测，将细胞培养在含有EGF、IGE和β-雌二醇的RPMI-1640+10%胎牛血清的培养基中，37℃、5%CO2中培养，取对数生长期的细胞进行试验。

1.3.2 荧光免疫方法鉴定原代卵巢癌细胞 将无菌的细胞爬片放在6孔板孔底，培养的原代细胞用4%胰蛋白酶消化后，调整细胞浓度至10 000个，每孔加入1 ml细胞悬液，放于37℃、5%CO2中培养培养过夜，第2天，吸尽细胞培养液，加入新鲜配制的2%多聚甲醛固定细胞10 min，PBS洗3次，每次5 min。用0.3%的Triton-100对细胞透化处理10 min，PBS洗3遍，每次5 min。用10%二抗同源血清封闭30 min，PBS洗3遍，每次5 min。加入一抗CK7(1∶200)，4℃孵育过夜(大于18 h)，PBS洗3遍，每次5 min。加入荧光二抗(1∶100)，37℃孵育1 h，PBS洗3遍，每次5 min。加入 Hoechest 33258染色细胞10 min，PBS洗3遍，每次5 min，去除多余的Hoechest 33258。取出细胞爬片，正面向下放在载玻片上封片。在荧光显微镜下观察。上述的试剂均用PBS配制。

1.3.3 MTT法检测细胞增殖 对数生长期细胞配制成细胞悬液，按每孔5 000个细胞种于96孔板中，待细胞贴壁后，以紫杉醇作为阳性药物，每孔加入不同浓度的AIFP，分别培养24、48、72 h后每孔加入 MTT(5 mg/ml)20 μl，继续孵育 4 h 后，终止培养，吸取孔内液体，每孔加入150 μl DMSO，振荡10 min，490 nm波长下测定各孔吸光度(OD)，每组5个复孔，计算每组均值。细胞存活率(%)=［(OD实验组－ OD空白)/(OD阴性对照组－ OD空白)］×100%。

1.3.4 AnnexinV/PI双染检测细胞凋亡 用不含EDTA的0.4%胰蛋白酶消化并收集对数生长期的细胞，调整细胞浓度，接种于6孔板中，每孔接种细胞104个，置37℃、5%CO2中培养至细胞贴壁，每孔加入不同浓度的AIFP，分别培养24、48、72 h后收集细胞。用冷的 PBS洗涤2次，每管加入500 μl Binding Buffer悬浮细胞，每管加入5 μl AnnexinVFITC混匀，然后加入5 μl PI混匀，室温避光反应15 min后，在流式细胞仪上进行检测，并以未处理的细胞为阴性对照，紫杉醇处理的细胞为阳性对照，用Modfit软件进行分析。

1.3.5 RT-PCR检测凋亡相关基因的表达 设计基因 Akt、CDC25C、cyclinB1及内参 β-actin引物序列和片段长度见表1。PCR目的基因引物及内参由上海生工生物工程有限公司合成。TRIzol法提取总RNA，然后分别逆转录合成cDNA，再进行PCR扩增。PCR条件:Akt为94℃ 4 min，94℃ 30 s，59℃退火30 s，72℃ 30 s。CDC25C为94℃ 4 min，94℃ 30 s，56℃退火30 s，72℃ 30 s。cyclinB1为94℃ 4 min，94 ℃ 30 s，59 ℃退火30 s，72 ℃ 30 s。βactin为94 ℃ 4 min，94 ℃ 30 s，56 ℃退火30 s，72℃ 30 s。目的基因与内参均扩增35个循环。

1.4 统计学处理 采用SPSS 13.0统计软件分析，数据以±s表示，用t检验进行差异分析。

2 结果

2.1 免疫荧光法检测原代细胞的纯度 特异性抗体CK7作为一抗，用带有FITC免疫荧光的二抗，对癌细胞膜进行染色，用Hochest 33258对细胞核进行染色。荧光显微镜下，癌细胞膜带有绿色荧光，癌细胞核带蓝色荧光，见图1。从图1可知，培养的细胞是卵巢癌细胞，其纯度为84.61%，可以进行下步实验。

表1 Akt、CDC25C、cyclinB1及内参β-actin引物序列和片段长度

图1 免疫荧光鉴定原代卵巢癌细胞的结果 ×200

2.2 AIFP对SKOV3细胞增殖的影响 不同浓度的融合肽作用于SKOV3细胞不同时间，随着浓度的增加和作用时间的延长，细胞的存活率降低。以不处理作为阴性对照，以0.5 μg/ml紫杉醇处理作为阳性对照，AIFP组对SKOV3细胞增殖的抑制率随AIFP浓度增加和作用时间的延长而增加，与阴性对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05，P＜0.01)。根据数据作出生长抑制曲线，然后根据曲线求出AIFP作用于SKOV3细胞24、48和72 h的ID50分别为2.75 ×10－4、3.96 ×10－5和 3.96 ×10－6mg/ml。见图2。

图2 AIFP对卵巢癌SKOV3细胞增殖的影响

2.3 AIFP肽对原代卵巢癌细胞增殖的影响 不同浓度的AIFP作用于原代卵巢癌细胞24、48、72 h后的细胞存活率，以0.5 μg/ml的紫杉醇做为阳性对照，培养液作为阴性对照。根据数据作出生长抑制曲线，然后根据曲线求出AIFP作用于原代卵巢癌细胞 24、48、72 h 的 ID50分别为 1.74 ×10－4、2.33×10－5和 3.12 × 10－6mg/ml。与阴性对照组比较AIFP各浓度处理原代卵巢癌细胞存活率明显下降，差异有统计学意义(P＜0.05，P＜0.01)，且有时间和剂量依赖性，见图3。

图3 AIFP对原代卵巢癌细胞增殖的影响

图4 AIFP对原代卵巢癌细胞凋亡的影响

2.4 AIFP对原代卵巢癌细胞和SKOV3细胞凋亡的影响 用不同浓度的AIFP作用于原代卵巢癌细胞和SKOV3细胞24、48和72 h后细胞凋亡的结果，培养液作为阴性对照，阳性对照用0.5 μg/ml紫杉醇处理，与阴性对照组比较AIFP组对卵巢癌细胞凋亡的影响随AIFP浓度增加和作用时间的延长而增加，见图 4、5。

图5 AIFP对卵巢癌SKOV3细胞凋亡的影响

2.5 RT-PCR检测卵巢癌相关基因表达水平的变化 AIFP下调 SKOV3细胞中 Akt、CDC25C、cyclinB1基因的表达水平，且随AIFP浓度的增加和作用时间的延长而更加明显，与阴性对照组比较差异有统计学意义(P ＜0.05，P ＜0.01)，见图6、7。

图6 AIFP对SKOV3细胞凋亡和周期相关基因表达的影响

3 讨论

LfcinB是一类富含色氨酸的小分子抗菌肽，由牛乳铁蛋白在消化道内经胃蛋白酶水解而产生。LfcinB具有抗菌、抑杀肿瘤细胞［5－6］等多种生物学功能，可用于保健食品、化妆品、药品等。乳源免疫调节肽能促进机体的免疫、抗氧化、延缓机体衰老和抗疲劳等多种功能。本实验室前期研究［7－8］显示，将LfcinB和免疫调节肽通过柔性连接臂［9］(GGGGS)连接，形成融合肽，并在大肠杆菌表达系统中稳定表达。研究［10］表明融合肽在抑制细胞增殖和抗菌方面有一定的效果，本实验将在前期研究结果中进一步研究融合肽对卵巢癌细胞株SKOV3细胞增殖和凋亡方面的影响。

图7 AIFP对SKOV3细胞凋亡和周期相关基因表达的影响

Akt又称蛋白激酶B(protein kinases B，PKB)，是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，是磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinases，PI3K)下游的靶蛋白，是PI3K/Akt信号途径的中心环节，该信号途径参与调节细胞的存活、凋亡、扩增、恶性肿瘤的发生及化疗耐药等［11］。PI3K/Akt卵巢癌中高表达，与卵巢癌细胞的凋亡相关［12］。

CDC25C即细胞分裂周期蛋白25同源蛋白，是一种细胞分裂周期蛋白，在真核细胞有丝分裂中期重要作用，是调控细胞周期进入M期的关键因子之一。CDC25C是 CDC2/cyclinB的主要激活物，CDC2/cyclinB是一个主要的G2/M期转变在G2期检查点的总开关［13］。当CDC25C磷酸酶活性受到抑制时，CDC2/cyclinB复合物的活性也将受到抑制，G2期检查点的总开关处于“关闭”状态，发生G2/M期阻滞。

cyclinB即细胞周期蛋白B，分为6中亚型，cyclinB1-6，在S期开始表达，在G2/M期达到峰值，到有丝分裂中后期消失［14］。cyclinB的过表达能够促进G2/M期转换，甚至导致细胞增生失控以及恶性转化。研究［15］表明，用 RNA干扰的方法抑制 cyclinB表达，结果造成G2/M期阻滞，细胞生长被抑制，并诱导细胞凋亡。

本实验用MTT法检测显示AIFP作用卵巢癌细胞株SKOV3细胞后，细胞的增殖减少，RT-PCR检测结果显示，AIFP作用后的 SKOV3细胞的 Akt、CDC25C和cyclinB1在一定范围内随时间和剂量的增加表达水平降低，说明AIFP对SKOV3细胞增殖和凋亡的影响可能是通过影响Akt、CDC25C和cyclinB1而发挥作用，为深入研究AIFP抗肿瘤的作用机制提供了可靠的依据。

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