草鱼冷藏期间ATP关联物含量及新鲜度变化

刘 焱，陈桂平，张继红，卢 君

（1.湖南农业大学食品科学技术学院，湖南 长沙 410128；2.食品科学与生物技术湖南省重点实验室，湖南 长沙 410128；3.湖南省食品质量监督检测所，湖南 长沙 410002）

鱼肉味道鲜美、营养丰富，具有高蛋白、低脂肪、低胆固醇等优点，营养平衡性好，是人体摄取动物蛋白质的重要来源之一。我国淡水鱼资源丰富，但生产季节性强，并且鱼肉极易腐败变质，所以鱼肉的保鲜贮藏显得尤其重要。鱼肉在贮藏过程中新鲜度会不断降低，发生蛋白质变性、腺嘌呤核苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）降解、脂肪氧化等，鱼肉风味的损失、苦味的增加、口感品质的降低与这些变化密切相关[1]。

ATP代谢关联物是鱼肉中重要的呈味物质。鱼在死后会发生酶催化ATP的降解反应，依次降解为腺苷二磷酸（adenosine diphosphate，ADP）、腺苷酸（adenosine monophosphate，AMP）、肌苷酸（inosine monophosphate，IMP）、次黄嘌呤核苷（inosine，HxR）和次黄嘌呤（hypoxanthine，Hx）。其中，肌苷酸是一种鲜味化合物，目前已作为衡量肉质鲜味的重要指标，最终产物次黄嘌呤会产生苦味影响口味，而AMP有压抑苦味的特性，是种良好的风味增强剂[2-4]。目前淡水鱼贮藏过程中品质变化研究都集中于鱼肉蛋白质的变性和挥发性风味成分的变化，关于呈味核苷酸的研究很少且不完善，对草鱼肉中呈味核苷酸的分析研究更是空白。因此本研究通过分析草鱼冷藏期间呈味核苷酸含量的变化，结合新鲜度指标挥发性盐基氮（total volatile base nitrogen，TVB-N）含量的检测和综合感官评价，找出草鱼肉中各核苷酸的含量与其新鲜度的相关性，以期能为草鱼在冷藏期间风味品质的保证提供理论参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

新鲜草鱼两条，2 kg左右，体长约60 cm，购于长沙高桥菜市场。

ATP-2Na、ADP-2Na、IMP-2Na、AMP-Na、HxR、Hx标准品 德国Ruibio公司；甲醇为色谱纯；高氯酸、磷酸二氢钾、氢氧化钠、氧化镁、硼酸、盐酸、乙醇、甲基红、次甲基蓝（均为分析纯） 国药集团化学试剂公司。

FSH-2A高速匀浆机 金坛市国旺实验仪器厂；TMP-510电子分析天平 湘仪天平仪器公司；LD5-2A离心机 北京医用离心机厂；1100高效液相色谱 美国Agilent公司。

1.2 方法

1.2.1 样品处理

将新鲜的草鱼去头、尾、鳞、内脏后，去骨采背部肉，制成鱼块置于4 ℃冰箱中保存待用。分别于冷藏后2、4、6 d取样，进行高效液相色谱分析和TVB-N含量检测。

1.2.2 ATP关联物含量的测定

1.2.2.1 草鱼ATP关联物的提取与转化[5-8]

取新鲜草鱼肉与冷藏后2、4、6 d的样品，切碎后取10 g放入离心管，加入预冷后的5%高氯酸溶液20 mL，匀浆后预冷10 min，5 000 r/min离心5 min，取上清液。沉淀用5%高氯酸洗涤重新离心取上清液。合并上清液，用NaOH饱和溶液调pH值为7.8[9]，静置5 min后过滤至100 mL容量瓶，超纯水定容后过0.45 μm待用。

1.2.2.2 ATP关联物梯度质量浓度混合标准液的配制

单样标准品（1 mg/mL）：称取25 mg分别定容至25 mL容量瓶中定容；混合标准品（100 μg/mL）：吸取6 种单样标准品各1 mL至10 mL容量瓶中定容；混合标准品（50、20、10、5 μg/mL）：分别吸取100 μg/mL的混合标准品5、2、1、0.5 mL至10 mL容量瓶中定容。

1.2.2.3 ATP关联物的高效液相色谱检测[5,10-12]

高效液相色谱（highper for manceliquid chromatography，HPLC）条件：色谱柱Capcellpak C18（4.6 mm×150 mm），0.05 mol/L磷酸二氢钾-甲醇（90∶10，V/V）等度洗脱，柱温30 ℃，检测波长260 nm，流速0.8 mL/min，上样量10 μL。通过比较样品和标准化合物的保留时间和峰面积来确定ATP关联物的种类和含量。

1.2.2.4 计算公式

式中：m为样品核苷酸钠盐的检测含量/（mg/kg）；M核苷酸、M核苷酸钠盐分别为核苷酸和核苷酸钠盐的相对分子质量。

1.2.3 TVB-N含量的测定

按GB/T 5009.44—2003《肉与肉制品卫生标准的分析方法》[13]规定的方法检测，每个样品做3 个平行，计算其平均值。

1.2.4 感官评价

参考杨文鸽等[14]的方法略作修改。感官评价以草鱼肉块的色泽、气味、组织结构和弹性，水煮鱼块的气味、滋味和汤汁形态作为指标。感官评定人员由随机抽取15 名人员组成，分别对生鱼块和水煮鱼块6 个指标进行评分，评定人员需在感官评定半小时前盐水漱口。每一指标取平均分后按生鱼块和水煮鱼块分别统计后再按总分10 分制计分。水煮鱼块定量25 g肉加250 mL纯净水加盖煮沸8 min[15]。具体评分标准见表1。

2 结果与分析

2.1 ATP关联物混合标准品的标准曲线和回归方程

表1 冷藏草鱼块感官评定表Table 1 Criteria for sensory evaluation of grass carp

图1 ATP关联物混合标准品的标准曲线和回归方程Fig.1 Standard curves and regression equations for ATP-related compounds

2.2 ATP关联物混合标准品和鱼肉样品的HPLC图谱

图2 混合标准品（20 μg/mL）HPLC图谱Fig.2 HPLC pro file of mixed standards (20 μg/mL)

图2为含有6 种标准化合物ATP-2Na、ADP-2Na、IMP-2Na、AMP-Na、HxR、Hx的高效液相色谱图谱，出峰的先后顺序为ATP-2Na（3.580 min）、IMP-2Na（3.867 min）、ADP-2Na（4.113 min）、AMP-Na（6.066 min）、Hx（6.736 min）、HxR（7.150 min）。在本色谱条件下，ATP系列关联物8 min内就能得到有效分离，杨文鸽[14]、刘亚[12]等的分离时间为35 min，戚晓玉[16]、伍彬[17]等的分离时间在30 min左右。可见将不稳定的ATP系列化合物转化成其钠盐形式，不仅方便其检测并且大大缩短了分离时间，其重现性效果也好。

图3 新鲜草鱼肉样品HPLC图谱Fig.3 HPLC pro file of ATP-related compounds from fresh grass carp meat

经过图3峰值计算，新鲜草鱼肉中ATP含量为273.17 mg/kg、ADP含量为95.22 mg/kg、IMP含量为504.34 mg/kg、AMP含量为62.38 mg/kg、HxR含量为51.76 mg/kg、Hx含量为8.62 mg/kg。从图3可以看出，新鲜草鱼肉中IMP含量明显高于其他关联物。IMP的含量对肉的滋味和香味都有重要影响，是畜、禽和鱼肉中的主要鲜味化合物[18-20]，新鲜草鱼肉质鲜美与高含量的IMP密切相关。

图4 新鲜煮制草鱼肉样品HPLC图谱Fig.4 HPLC pro file of ATP-related compounds from cooked fresh grass carp meat

由图4经过峰面积计算，煮制的新鲜草鱼肉中ATP含量为281.62 mg/kg、ADP含量为177.68 mg/kg、IMP含量为654.35 mg/kg、AMP含量为80.99 mg/kg、HxR含量为34.44 mg/kg、Hx含量为4.84 mg/kg。煮制的新鲜草鱼肉中IMP含量也明显高于其他关联物。与未煮制的新鲜草鱼肉相比较，ATP含量稍有增加，ADP含量增加了86.60%、IMP含量增加了29.74%、AMP含量增加29.83%、HxR含量减少33.46%、Hx含量减少43.85%。经过煮制的草鱼肉中促进风味作用的ATP关联物含量都有所增加，产生苦味的Hx含量则明显下降，说明加工过程可以影响鱼肉风味物质含量的变化从而改变鱼肉的口感。

2.3 草鱼冷藏期间ATP关联物含量的变化

图5 草鱼冷藏期间ATP、ADP、IMP（A）和AMP、Hx、HxR（B）含量的变化Fig.5 Changes in the levels of ATP, ADP, IMP, AMP, Hx, and HxR in grass carp meat during cold storage

从图5可看出，冷藏过程中含量下降最快、下降幅度最大的为ATP和IMP。ATP只在新鲜的鱼肉中检测到，冷藏第2天就已检测不出其含量。ATP含量的快速下降跟鱼死后其合成受阻和高活性的ATP酶快速降解有关，并且Watabe等[21]研究认为，在较低的贮藏温度条件下肌浆网状结构的钙吸收能力下降，肌原纤维内钙浓度增加，钙离子能激活肌原纤维Mg2+-ATP酶，加速ATP的降解。在冷藏第2天，IMP从504.34 mg/kg下降到36.48 mg/kg，下降幅度达92.77%，此后一直呈缓慢下降趋势。有研究[2]以鸡肉为例，屠宰后在4 ℃保存约8 h时，IMP含量最多，此后逐渐减少，与本研究含量变化基本一致。IMP与谷氨酸钠对鲜味有相乘效应，混合存在时增味效果明显增强。作为重要的鲜味化合物，新鲜鱼肉和冷藏鱼肉中IMP含量的巨大差异可以从风味方面解释冷藏鱼肉口味为何不如新鲜鱼肉。

图5还显示，ADP在冷藏周期内含量先上升后下降，总体变化不大。AMP的含量一直维持在一个平稳的水平。这都与ATP的降解有关。伍彬等[17]认为，AMP有压抑苦味的特性，能使食物产生理想的甜味和咸味，是种良好的风味增强剂。图5显示在冷藏第2天，Hx含量从8.62 mg/kg上升84.64 mg/kg，上升幅度达到89.82%，此后一直维持较高的含量。HxR的含量则一直呈下降趋势，从新鲜鱼51.76 mg/kg一直下降到24.17 mg/kg。Hx为ATP降解途径中的最终产物，前体物质的快速降解导致了Hx含量的快速上升，这与鱼体开始出现细菌腐败分解密切相关[22-23]。Hx被认为可导致食物苦味，使鱼的风味变差[24]。

2.4 草鱼冷藏期间总TVB-N含量的变化

图6 草鱼冷藏期间TVB-N含量的变化Fig.6 Changes in TVB-N contents in grass carp meat during cold storage

如图6所示，草鱼冷藏过程中总TVB-N含量呈上升趋势。新鲜时含量为5.52 mg/100 g，冷藏2 d时含量为10.32 mg/100 g，4 d时为17.24 mg/100 g，第6天为32.07 mg/100 g。TVB-N含量与鱼肉蛋白质自溶和细菌繁殖分解相关。冷藏过程中低温有抑制酶活与细菌繁殖的作用，贮藏初期鱼肉蛋白质缓慢自溶水解。随着贮藏时间的延长，其降解的大量产物为微生物的生长提供了天然的培养基，细菌开始大量繁殖，使氨基酸脱羧基或氨基生成胺类、氨气等异味物质。因此冷藏6 d时，鱼肉在内外环境的作用下产生大量TVB-N。鱼类TVB-N的量达到30 mg/100 g时[20]，即被认为是变质的标志，实验结果可以认为鱼肉的冷藏周期在6 d以内。

2.5 草鱼冷藏期间的感官评定

图7 冷藏期间生鱼肉（A）和熟鱼肉（B）感官评定Fig.7 Sensory evaluation of raw grass carp (A) and cooked grass carp meat (B) during cold storage

从图7A可以看出，生鱼肉在冷藏2 d后较新鲜鱼感官有所下降，在冷藏2～4 d感官变化不太明显，但在第4天后呈明显下降。从图7B可以看出，随着贮藏时间的延长，鱼肉煮制后的感官评定明显下降趋势。

刚宰杀的新鲜鱼肉表面湿润光滑，颜色鲜白红润，有清淡的青草味，些许腥味但气味柔和，用手指轻压后凹陷立即回复；经水煮后肉香味浓郁，汤汁清澈，入口肉质细嫩有弹性。冷藏2 d后鱼肉表面开始发干，色泽正常但光泽度低；煮制后肉香味明显但不如新鲜鱼肉鲜美，汤汁清晰但表面有少许漂浮泡沫。冷藏4 d后，鱼肉表面产生黏液，手触黏稠，颜色稍微暗淡，手指轻压后回复速度慢；水煮后汤汁漂浮少量碎肉，肉鲜味平淡，肌肉组织缺乏弹性造成口感明显下降。到第6天感官评定时鱼肉已有不愉快异味，表面大量黏液，腥臭味明显；水煮后汤汁混浊，此时鱼肉已轻微腐败。

3 结 论

新鲜草鱼肉含有较高含量的鲜味化合物IMP，但在冷藏过程中蓄积时间很短。冷藏后ATP含量快速下降但ADP、AMP保持稳定未出现积累现象。ATP关联物最终以Hx为主要蓄积物，说明草鱼为Hx生成型鱼种。冷藏后草鱼TVB-N含量一直上升，结合ATP关联物变化趋势和感官评定结果，高含量的IMP与肉质鲜美密切相关，而Hx含量的蓄积则说明鱼肉细菌腐败的程度。冷藏2 d的草鱼处于一级品范围，TVB-N＜13 mg/100 g，6 d后肉质已腐败，TVB-N＞30 mg/100 g[25]。低温冷藏虽然能有效抑制细菌繁殖，延缓鱼肉的腐败，但不能很好地保持鱼肉的鲜味和口感。因此研究草鱼冷藏期间ATP关联物含量的变化，探究其风味物质变化的机理，进一步分析如何保持鱼肉在贮藏过程中风味物质的稳定具有重要意义。

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