山葡萄转录因子CBF1基因的克隆及其遗传转化体系

刘洋

摘 要：根据山葡萄的CBF1基因序列设计一对特异引物，克隆出山葡萄（Vitis amurensis）栽培品种 ‘双优的抗寒转录因子CBF1基因，并将其构建到pBI121表达载体中，获得山葡萄转录因子CBF1基因的植物表达载体，命名为pBI121-ViCBF1，利用农杆菌介导叶盘转化‘巨峰葡萄以研究高效的‘巨峰葡萄转化体系。结果表明，以农杆菌LBA4404为介导菌株，以‘巨峰葡萄叶片为外植体、3 d为预培养时间和4～5 d共培养时间、400 mg·L-1羧苄青霉素，50 mg·L-1卡那霉素筛选浓度转化效果较好，并已筛选到6株转基因植株，PCR检测均为阳性，为提高‘巨峰葡萄的抗寒性建立了初步的技术基础。

关键词：山葡萄；表达载体；转录因子；遗传转化

中图分类号：S663.1 文献标识码：A DOI编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2014.02.002

Cloning of Transcription Factor CBF1 of Vitis amurensis and Its System of Genetic Transformation

LIU Yang

（Changchun Vocational University， Changchun， Jilin 130033，China）

Abstract： Designing a pair of single primer by CBF1 gene of Vitis amurensis，cloning transcription factor CBF1 gene of Vitis amurensis， the vector of pBI121-ViCBF1 was constructed and transformed to Vitis labruscana Kyoho by agrobacterium-mediated method. The regenerated resistant plants could be obtained by pre-culturing for 3 d， coculturing with Agrobacterium tumefaciens LBA4404 for 4～5 d， and then transferred to the callus inducement media containing 400 mg·L-1 Carb and 50 mg·L-1 Kan for 28 d. Under this construction， the rate of plant transformation was relatively higher and six putative transgenic plants had gotten， product of PCR was positive， the system was an elementary technology for increasing cold resistance of Vitis labruscana Kyoho.

Key words： Vitis amurensis； expression vector； transcription factor； genetic transformation

当前，随着农业生态环境的不断恶化，低温、干旱及高盐严重威胁着现代化农业的发展。我国东北和西北两地农作物冻害发生普遍，因冻害所造成的损失也十分严重。我国东北山葡萄抗寒性最强（耐-40 ℃低温），在山葡萄中发现的CBF 低温反应途径是，通过CBF 转录因子调控大量下游有CRT/DRE（C-repeat/dehydration responsive element）调控元件的COR（cold-regulated）基因的表达，来提高植物的抗冻力[1-2]。据报道，大量表达拟南芥CBF1基因的转基因植物，其抗寒性平均提高了10.8 ℃[3]。因此，大量表达抗寒功能更强的山葡萄CBF1基因的‘巨峰葡萄，其抗寒能力很可能强于转拟南芥CBF1基因的植株，这种转基因‘巨峰葡萄将能在东北乃至更寒冷的地区露地安全越冬，从而改变传统的“埋土防寒”措施，减少作物因低温天气造成的减产，具有广阔的应用前景。

1 材料和方法

1.1 材 料

山葡萄（Vitis amurensis Rupr.）栽培品种‘双优、‘巨峰葡萄（Vitis labruscana Kyoho）、大肠杆菌E.coli DH5α、农杆菌LBA4404感受态细胞、表达质粒pBI121均由吉林农业大学生命科学院提供。克隆载体为pGEM-T easy vector购自宝生物工程（大连）有限公司。TaqDNA聚合酶、限制性内切酶T4DNA连接酶购自上海生工生物工程公司。DNA提取试剂盒、及切胶回收试剂盒均购自宝泰克公司。

1.2 山葡萄CBF1基因的克隆

根据已知的山葡萄CBF1基因序列设计引物，在其上游、下游分别引入XbaⅠ、SacⅠ酶切位点，上游引物：5′-CCATCTAGACCATGGACTCGGACCACGAAG-3′，下游引物：5′-TGAGCTCTTAATCATCATTCCACAAAGACAAGTC-3′。引物由Takara（大连）公司合成。

提取山葡萄的RNA，逆转录后获得cDNA，并以此为模版PCR扩增后获得CBF1基因的编码序列，连接在pMD18-T载体上转化大肠杆菌，提取质粒酶切鉴定，最后进行测序。

逆转录体系为：取mRNA5 μL（≤2 μg），反转录酶4 μL，buffer（5×）4 μL，dNTP （10 mmol·L-1）2 μL，RNase Ribonuclease Inhibitor 0.5 μL，DEPC水3.5 μL，70 ℃水浴变性5 min，冰浴5 min稍离心，慢慢混匀后，低速离心，收集液滴，42 ℃温浴60 min，85 ℃加热10 min灭活反转录酶，得到cDNA。

PCR反应体系：以cDNA为模板进行PCR扩增，20 μL的体系包括0.5 μL cDNA，2 μL buffer（10×），2 μL Mg2+（25 mmol·L-1），0.25 μL dNTP（10 mmol·L-1），0.5 μL P1，0.5 μL P2，0.25 μL Taq酶（5 U·μL-1），14 μL ddH2O，扩增引物见表1，扩增程序为下：94 ℃预变性6 min，94 ℃变性30 s，52 ℃退火40 s，72 ℃60 s，72 ℃延伸8 min。4 ℃保存。循环后72 ℃保温延伸10 min。

1.3 植物表达载体pBI121-ViCBF1的构建

用XbaⅠ和SacⅠ分别酶切目的基因和质粒载体，目的DNA 片段回收后用T4 连接酶连接，并将此重组体转化导入大肠杆菌DH5α 感受态细胞中，在含有50 mg·L-1Amp 的培养基平板上培养，挑取白斑用XbaⅠ和SacⅠ双酶切鉴定，得到植物表达载体pBI121-ViCBF1。

1.4 遗传转化体系的建立

农杆菌液侵染外植体和与其共培养。在转化前1 d，将已转化了植物表达载体质粒的农杆菌菌液接种于YEP液体培养基上（含利福平30 mg·L-1、卡那霉素50 mg·L-1），27 ℃，180 r·min-1培养过夜， 4 ℃4 000 r·min-1离心5 min，取沉淀用无菌的MS液体培养基稀释，测定OD600值分别为0.2，0.4，0.6，0.8时取出使用。取切好的叶片，分别在愈伤组织诱导芽分化培养基上预培养1，2，3，4，5 d。后将预培养后的外植体放入农杆菌菌液中7～10 min，取出后用无菌纱布吸干外植体表面残留的菌液，然后接种于放入不含任何抗生素的愈伤组织和不定芽诱导培养基，25 ℃暗室共培养3，4，5，6 d，待叶片在培养基接触处长出肉眼可见菌落时，转入含有卡那霉素（20，30，40，50 mg·L-1）和羧苄青霉素（300，400，500，600 mg·L-1）的愈伤组织诱导和不定芽分化培养基中，一个月后统计分化率，将筛选出的再生苗转入含有抗生素的根诱导培养基中诱导生根，形成再生植株。

1.5 筛选转基因纯合植株

待芽长至1 cm左右时切下，移入MS生根培养基（含羧苄青霉素400 mg·L-1，卡那霉素50 mg·L-1）中，促其生根，根系发育好后（5～6片叶），提取叶片组织DNA，进行基因CBF1的PCR检测。

2 结果与分析

2.1 山葡萄CBF1基因的扩增

通过PCR扩增得到山葡萄CBF1基因特异片段，经测序结果为752 bp，与预期相符，如图1。山葡萄CBF1基因的开放阅读框包含752个核苷酸对。

2.2 山葡萄植物表达载体pBI121-ViCBF1的构建

2.2.1 植物表达载体的构建 在CBF1基因两端引入XbaI 和SacⅠ酶切位点，分别用XbaI 和SacⅠ分别酶切目的基因和pBI121载体，构建pBI121-ViCBF1表达载体（图2）。

2.2.2 植物表达载体的鉴定 经PCR鉴定为阳性的菌液提取质粒，用XbaI 和SacⅠ双酶切鉴定重组质粒，电泳结果中出现一条752 bp左右的目的条带（图3）。

2.2.3 根癌农杆菌菌落PCR检测 挑选农杆菌阳性克隆进行菌落PCR检测，出现预期条带（图4），XbaI 和SacⅠ双酶切鉴定也显示同样大小的目的条带，表明CBF1插入到了载体中，表明已成功构建植物表达载体，可用于‘巨峰葡萄的遗传转化。

2.3 ‘巨峰葡萄遗传转化体系的建立

2.3.1 农杆菌的浓度及预培养、共培养时间对遗传转化效率的影响 农杆菌的浓度适宜才能实现有效转化[4-6]。本试验中侵染‘巨峰葡萄的农杆菌浓度是OD600=0.6～0.8，侵染时间控制在6 min最适宜。

外植体的预培养时间过长会导致伤口愈合，不利于外源基因的转化，本试验中适宜的预培养时间为3 d（图5）。外植体与农杆菌的共培养时间太短不利于基因的转化，共培养时间过长，农杆菌过渡繁殖造成外植体的褐化死亡。试验中，‘巨峰葡萄与农杆菌的共培养时间应控制在4～5 d（图6）。

2.3.2 抗生素敏感性试验 本试验采用羧苄青霉素的抑菌效果进行筛选[7]。本试验确定羧苄青霉素浓度为400 mg·L-1为最适宜浓度，此浓度培养基中农杆菌的生长受到有效抑制。

不同植物基因型不同，对卡那霉素的敏感性也不同[8-9]。本试验中，卡那霉素对对‘巨峰葡萄的生长有明显的抑制作用。当卡那霉素浓度为50 mg·L-1时，‘巨峰葡萄无法正常生长（图7），此浓度是较为适宜的筛选浓度。因此，以卡那霉素浓度50 mg·L-1，羧苄青霉素浓度为400 mg·L-1筛选‘巨峰葡萄拟转基因植株（图8）。

2.3.3 转基因‘巨峰葡萄PCR检测 仅凭卡那抗性筛选得到的阳性植株，并不能充分说明就是转基因植株。因为不同个体间的卡那抗性也有差异，另外该基因是否在后代中稳定表达，还需用分子生物学手段来检测[10]，最方便快捷的方法是PCR扩增。待转基因‘巨峰葡萄长到5～6片叶片时，为了筛选带有CBF1基因的转基因‘巨峰葡萄植株，对筛选到的6株拟转基因植株进行PCR检测。结果表明，转基因‘巨峰葡萄6个单株均扩增出了特异性的目的条带（图9）。

3 结论与讨论

本研究初步建立了山葡萄CBF1基因的植物表达载体pBI121-ViCBF1，为了提高pBI121-ViCBF1对‘巨峰葡萄的转化效率，在试验中确立了外植体预培养时间为3 d、农杆菌的侵染浓度OD600=0.6～0.8、外植体与农杆菌的共培养时间4～5 d。并对羧苄青霉素浓度及筛选阳性植株的卡那霉素浓度进行了优化（羧苄青霉素浓度为400 mg·L-1，卡那霉素浓度50 mg·L-1），以此浓度作为‘巨峰葡萄抗性植株的筛选，88个外植体筛选到6株拟转基因植株，转化率为6.81%，PCR检测结果均为阳性，初步说明转录因子CBF1基因已经整合到‘巨峰葡萄的基因组DNA中。

此外，本研究构建了pBI121-ViCBF1单子叶植物表达载体，利用CaMV35S启动子启动CBF1基因在‘巨峰葡萄中的超表达，在提高基因植株耐逆性的同时，还会产生生长迟缓、植株矮化、产量下降等不良影响，但这种负效应可以用植物内源特异性启动子rd29A基因取代CaMV35S来在很大程度上减轻这种负效应，从而提高抗寒基因工程的实效性。

参考文献：

[1] Thomashow M F， Gilmour S J， Stockinger E J， et al. Role of the Arabidopsis CBF transcriptional activators in cold acclimation[J]. Plant Physiol， 2001， 112： 171-175.

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[3] Jaglo K R， Kleff S， Amundsen K L， et al. Components of the Arabidopsis C-repeat/dehydration element binding factor cold-response pathway are conserved in Brassica napus and other plant species[J]. Plant Physiol， 2001， 127： 910-917.

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[5] 梁超，王景雪，裴雁曦，等.根癌农杆菌介导的番茄高效遗传转化体系的研究[J].华北农学报，2009（2）：71-74.

[6] 邵敏，周鹤峰，葛正.龙农杆菌介导的hIL-12基因转化马铃薯的研究[J].华北农学报，2008（3）：46-49.

[7] 安利佳，李凤霞，张俊敏，等. 豆科植物组织培养的研究 [J].植物学报，1993，34（10）：743-752.

[8] 王关林，方宏筠. 植物基因工程[M].北京：科学出版社，2002：795-798.

[9] 魏爱民，张文珠，杜胜利，等.黄瓜花粉管通道法抗虫基因导入及卡那霉素抗性筛选[J].华北农学报，2008（6）：54-57.

[10] 宋书锋，曹凤，杨培志，等. 普那菊苣高效再生体系建立和遗传转化研究[J].分子植物育种，2006（4）：123-128.

此外，本研究构建了pBI121-ViCBF1单子叶植物表达载体，利用CaMV35S启动子启动CBF1基因在‘巨峰葡萄中的超表达，在提高基因植株耐逆性的同时，还会产生生长迟缓、植株矮化、产量下降等不良影响，但这种负效应可以用植物内源特异性启动子rd29A基因取代CaMV35S来在很大程度上减轻这种负效应，从而提高抗寒基因工程的实效性。

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此外，本研究构建了pBI121-ViCBF1单子叶植物表达载体，利用CaMV35S启动子启动CBF1基因在‘巨峰葡萄中的超表达，在提高基因植株耐逆性的同时，还会产生生长迟缓、植株矮化、产量下降等不良影响，但这种负效应可以用植物内源特异性启动子rd29A基因取代CaMV35S来在很大程度上减轻这种负效应，从而提高抗寒基因工程的实效性。

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