苹果TCP转录因子家族生物信息学分析

张士刚

摘要：TCP蛋白家族是一类植物特有的转录因子家族，参与多种生理生化过程，具有重要的调控作用。本文利用生物信息学方法对苹果TCP转录因子家族成员、基因分类、基因结构、染色体定位、系统进化关系和结构域序列保守性进行了预测和分析。结果表明，苹果TCP基因家族包含52个成员，分为3类：Class Ⅰ、ClassⅡ和ClassⅢ；MdTCP蛋白含有115～612个氨基酸，等电点为5.41～10.65；除3号染色体外，其余16条染色体均有MdTCP基因分布，其中5号染色体最多，有7个。

关键词：苹果；TCP；转录因子；全基因组分析

中图分类号：Q754文献标识号：A文章编号：1001-4942（2014）05-0012-06

TEOSINTE BRANCHED1/CYCLOIDEA/PROLIFERATING CELL FACTOR1（简称TCP）家族是一类植物特有的转录因子家族。最早发现的家族成员是玉米TB1（teosinte branched 1）基因，金鱼草CYC（cycloidea）基因和水稻PCF1、PCF2基因，这4个基因编码的蛋白都包含一段由约60个氨基酸组成的保守序列，该保守序列能形成一种非典型的螺旋-环-螺旋结构（non-canonical basic-Helix-Loop-Helix structure）[1，2，3]。根据其代表成员TB1、CYC和PCFs的首字母缩写，把能够编码这段保守氨基酸序列的基因命名为TCP基因，把这段保守的氨基酸序列命名为TCP结构域[2]。TCP结构域中的螺旋-环-螺旋区域（bHLH）含有两个由保守的亲水氨基酸构成的中性螺旋结构和一个负责连接两个螺旋区域的环结构。在第二个螺旋区域有一个特异的“LXXLL”基序，动物bHLH蛋白的研究结果表明这段基序可以通过调控转录的共激活单元结合到核定位蛋白上[4]。TCP家族成员除了含有TCP结构域外，还存在一个保守的R结构域[5]，R结构域并不是所有的TCP转录因子共有的，它富含精氨酸、赖氨酸和谷氨酸等极性氨基酸，可以形成一个 亲水性的α螺旋[3]。

前人对CYC、TB1、PCFs和其他9条预测的拟南芥和玉米TCP基因进行了进化分析，结果表明，这12个基因可以被分为两个亚家族，一个包含有CYC和TB1，命名为CYC/TB1亚家族；另一个包括PCFs，命名为PCF亚家族。其中TCP结构域普遍存在于所有的TCP家族成员中，而R结构域则特异存在于CYC/TB1亚家族的一些基因中[3]。对多种菊亚纲植物的TCP基因家族成员之间的进化关系进行聚类分析，表明TCP基因家族在各物种间的多样化对其形态学上的进化具有重要作用[6]。Yao等通过对拟南芥23个TCP基因及水稻22个TCP基因的进化分析，将TCP家族分为三个亚家族：Class Ⅰ、Class Ⅱ和Class Ⅲ，同时对其结构域进行了序列比对，并分析了不同基因在不同组织中的表达模式[7]。

TCP家族转录因子主要在快速生长的组织或器官中表达，与植物细胞的分化和发育有密切关系。玉米TB1基因影响侧生分生组织的生长和发育[1，8，9]；水稻TB1基因被认为是水稻侧枝发育的负调控元件[10]；拟南芥TCP16基因对早期花粉的发育有重要作用[11]。拟南芥TCP20基因能够结合CYCB1的GCCCR元件，具有调控细胞分裂和生长的作用[12]，可与AtTCP9基因对抗性地调控拟南芥叶片发育和茉莉酸代谢过程[13]。研究表明，拟南芥中的5个TCP基因：TCP2、TCP3、TCP4、TCP10和TCP24是microRNA 319a的靶基因，参与调控叶片的形态发生[14]。豆科模式植物百脉根中的LjCYC1和LjCYC3参与调控花分生组织的生长发育过程，另一类豆科植物豌豆中的CYC类TCP基因也参与控制背腹轴向不同类型花瓣的发育[15，16，17]。

2010年8月，Velasco等在Nature Genetics上发表了关于‘金冠苹果基因组测序工作的文章，标志着苹果全基因组序列的测定已经完成[18]，这一成果将苹果生物学研究带入了崭新的系统生物学时代，为研究者从全基因组水平对苹果进行研究奠定了基础。苹果RING finger、MAPK和MAPKK、MdWRKY转录因子及DREB转录因子家族基因已通过生物信息学的方法鉴定出来，并进行了全基因组分析和基因功能预测[19～22]。目前TCP转录因子家族的研究主要集中在模式植物拟南芥、水稻和玉米中，蔬菜和果树尤其是苹果中的报道还非常少。本文从苹果全基因组出发，利用生物信息学的方法，鉴定出苹果全部的TCP转录因子，对其家族进化关系及结构域序列保守性进行了系统预测和分析，以期为进一步研究MdTCP基因的作用奠定一定的理论基础。

1材料与方法

从苹果功能基因组数据库（http：//www.appplegene.org/）下载TCP转录因子家族序列；从GDR数据库下载‘金冠苹果全基因组序列，构建本地Blast数据库，以拟南芥TCP转录因子家族基因序列执行本地Blast（1e-003）搜索[23]；合并两部分结果，利用Perl程序筛选，去掉重复序列，所得结果再利用PFAM及NCBI-CDD工具进行蛋白结构预测，删除不含TCP结构域的基因。利用ExPASy Proteomics Server（http：//expasy.org/），对所有TCP基因编码蛋白进行分子量、等电点预测。

从GDR数据库下载‘金冠苹果基因组信息文件（assembly gff3 file），利用Perl程序选取TCP基因的染色体位置信息，并利用MapDraw工具进行染色体定位作图。

用MUSCLE进行序列比对，选取TCP结构域序列，再利用 MEGA5构建进化树。进化树生成算法采用邻接法（Neighbor-Joining，NJ），校验参数Bootstrap 重复1 000次[24]；基因结构利用生物学软件Gene Structure Display Server（GSDS，http：//gsds.cbi.pku.edu.cn/）分析获得；保守性分析则采用DNAMAN生物学软件进行保守序列比对。

2结果与分析

2.1苹果TCP转录因子家族成员的鉴定

利用生物信息学方法，从苹果全基因组鉴定得到52个TCP转录因子家族成员，根据其系统进化树分析结果，对其进行了系统编号。MdTCP对应的基因编号、基因组登录号、编码序列长度、外显子数量、蛋白长度、分子量、等电点、所在染色体位置和拟南芥同源基因等特征见表1。由表1可知，MdTCP蛋白长度在115 aa（MdTCP50）～612 aa（MdTCP27）范围内，等电点在5.41（MdTCP32）～10.65之间（MdTCP3）。如图1所示，有49个MdTCP基因存在于不同染色体上，其中5号染色体最多，有7个；3号染色体上没有分布；其余染色体上各有1～5个MdTCP基因分布。另外有3个MdTCP基因MdTCP50、MdTCP51和MdTCP52未发现相应的染色体定位信息。

2.2苹果TCP转录因子家族系统进化及基因结构分析

如图2所示，MdTCP基因的内含子和外显子数量表现出了较高的保守性，其中没有内含子的MdTCP基因有32个，占总数的61.5%；有1个内含子的有9个，占17.3%；有2个内含子的有7个，占13.5%；有3个和5个内含子的MdTCP基因分别有2个，各占3.8%。

图2苹果TCP转录因子家族系统进化树和基因结构分析

2.3苹果与拟南芥TCP转录因子家族系统进化及保守结构域分析

进化树分析（图3）表明，52个MdTCP转录因子可分为ClassⅠ、ClassⅡ和Class Ⅲ三类，分别包括22、4和26个，其中第二类数量较少，这与拟南芥和水稻中的规律是一致的[7]。前人研究表明，拟南芥中有24个TCP家族成员[7，25]，由图3可知，不同的AtTCP转录因子与52个MdTCP转录因子有着不同的同源性，例如，AtTCP20与MdTCP22、MdTCP35、MdTCP47同源性较高，AtTCP9与MdTCP18同源性较高。对预测的52个苹果TCP转录因子蛋白序列进行保守结构域序列比对，结果发现，三类苹果TCP蛋白中均包含有TCP结构域，即TCP转录因子的特征序列——bHLH结构域（图4）。

3讨论与结论

随着越来越多物种全基因组测序工作的完成，海量的基因组数据、信息摆在我们面前，如何从这些数据中找到我们所需要的部分成为亟待解决的难题。利用生物信息学方法对基因组数据进行分析，研究各个物种间的进化关系和相互间的亲缘关系，以及物种内各基因家族成员的进化关系，能够为后续基因功能的研究提供一定的借鉴。本文利用生物信息学方法，对苹果基因组中的TCP转录因子进行了鉴定与分析。以期为今后研究苹果TCP转录因子的具体生理作用奠定一定的理论基础。

TCP转录因子在植物中分布较广，各物种间的分布数量存在一定差异。拟南芥TCP转录因子家族有24个成员，水稻有22个成员[7，25]，本研究鉴定了52个苹果TCP家族成员。通过系统进化分析发现，MdTCP22、MdTCP35、MdTCP47与AtTCP20的同源性较高，MdTCP18与AtTCP9的同源性较高，结合拟南芥研究结果，这些基因可能在苹果生长发育及代谢过程中起作用；而MdTCP8、MdTCP9、MdTCP10、MdTCP11、MdTCP25和MdTCP49与AtTCP2、AtTCP3、AtTCP4和AtTCP10的同源性较高，说明它们有可能作为microRNA的靶基因参与苹果叶片的发育。借鉴拟南芥、水稻及其它物种中TCP转录因子在植物生长发育和相关代谢过程中的功能研究，探索MdTCP转录因子在苹果生长发育尤其是叶片和侧枝、某些激素代谢过程中的功能及其相互作用机制是今后苹果相关研究的重点。

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