水稻渗透胁迫抑制表达基因的克隆与表达分析

叶子诚

摘要通过基因芯片技术，鉴定了一个PEG6000胁迫抑制表达基因。该基因编码MYB转录因子，命名为OsSRMYB1。荧光定量PCR研究结果表明，该基因的表达显著受PEG6000抑制，受氧化胁迫诱导，而低温和ABA处理下该基因的表达未发生显著变化。组织表达分析结果表明，OsSRMYB1基因在水稻不同组织中均有表达，在叶中表达量较高。在不同生长阶段的穗中，OsSRMYB1基因在发育中的穗中表达较高，在成熟穗和幼穗中表达量较低。本研究为进一步深入分析OsSRMYB1的生物学功能提供参考。

关键词MYB；水稻；渗透胁迫；穗发育；转录因子

中图分类号S511文献标识码A文章编号 1007-5739（2014）11-0009-03

Cloning and Expression Analysis of a Osmotic Stress Repressive Gene in Rice

YE Zi-cheng

（College of Agriculture，Nanjing Agricultural University，Nanjing Jiangsu 210095）

AbstractA gene encoding MYB transcription factor was identified as a PEG6000-repressive gene by microarray，designated OsSRMYB1.Real-time RT-PCR assay suggested that expression of OsSRMYB1 was significantly repressed by PEG6000，while not markedly changed upon ABA or cold stress. OsSRMYB1 expression existed in the different tissues of rice and the expression was the highest in leaves. The tissue-specific expression of OsSRMYB1 indicated that it was highly expressed in the developing panicles. This study provide reference for the depth analysis of the biological functional of OsSRMYB1.

Key wordsMYB；rice；osmotic stress；panicle development；transcription factor

植物对非生物胁迫的适应依赖于一系列信号级联反应的激活，包括胁迫信号的感知、信号转导、胁迫相关基因的表达及胁迫相关代谢物的积累，从而对损伤进行修复，进而对细胞的稳态进行重建。对胁迫相关基因编码产物的类型和作用进行分类，主要有以下2种：一类是直接保护细胞免受逆境胁迫的功能蛋白，如LEA蛋白、抗冻蛋白、离子信道蛋白以及渗透调节因子；另外一类是一种调控蛋白，其可参与到胁迫信号的传导和基因表达调节的过程中，包括转录因子、蛋白激酶等。已有研究表明，bZIP类、AP2/EREBP类、锌指蛋白、MYB/MYC类等多种类型的转录因子参与到植物的非生物胁迫应答中。MYB类转录因子包含MYB结构域，此结构域最早是在脊椎动物原癌基因v-Myb编码产物的DNA结合域中被发现[1]。YB转录因子一般定位于细胞核中，紧密地与核基质和染色质相连[2]。

根据MYB类转录因子所含有的MYB结构域的数目，可被简单地分成3个亚类[3]：一是只含1个MYB结构的MYB蛋白亚类成员，二是含有2个MYB结构域的R2R3亚类成员，三是含有3个MYB结构域的R1R2R3亚类成员。以前有相关的研究表明，MYB类转录因子广泛地在植物的各种反应中发生作用，包括细胞形态发生、次生代谢等。蔡新忠等[4]的研究结果证明MYB基因在番茄的抗旱中发挥一定的作用。Urao等[5]从拟南芥中分离出1个MYB基因Atmyb2，该基因的表达受到干旱、高盐以及ABA等的诱导，体外EMSA表明Atmyb2蛋白能够与MYB识别位点TAACTG进行特异性的结合。Abe等在分析一个足以响应干旱和ABA诱导的来源于rd22基因启动子的67 bp DNA序列时，鉴定了2个顺式作用元件，即MYC和MYB识别位点。瞬时表达分析表明Atmyb2能够促进rd22启动子驱动的报告基因的表达。Dene Kamp等[6]对拟南芥中MYB类转录因子AtMyb102的研究发现，经过NaCl和ABA处理后，与对照相比，AtMyb102的表达明显要高，在受到ABA处理后，其在拟南芥的根、茎、叶、小花中的表达量会得到显著的提高。通过基因芯片技术，笔者所在试验室实定了1个PEG6000胁迫抑制表达的基因。该基因编码MYB类转录因子，命名为OsSRMYB1。本研究将通过序列比对、结构域分析、表达特性研究等手段分析明确OsSRMYB1在非生物胁迫中可能的功能，为进一步深入分析OsSRMYB1的生物学功能提供基础。

1材料与方法

1.1植物材料及处理

水稻粳稻（Oryza sativa L.sub Japonica）品种韭菜青由笔者所在实验室内保存提供。水稻种子置于30 ℃环境中催芽2 d，将种子均匀地点播于96孔板中，于28 ℃培养箱中水培生长，条件为：光照16 h、黑暗8 h。营养液采用国际水稻所用的常规营养液配方[7]，待幼苗生长至3~4叶时，对幼苗按以下步骤处理：一是冷处理，将幼苗置于4 ℃环境中；二是模拟干旱处理，水稻幼苗营养液中加入20%的PEG6000；三是H2O2处理，水稻幼苗营养液中加入100 mmol/L H2O2；四是ABA处理，水稻幼苗营养液中加入0.05 mmol/L ABA。分时段（0、1、3、6、12、24、48 h）收集水稻幼苗地上部样品，液氮速冻后于-80 ℃保存，用于RNA的提取。

1.2总RNA的提取

提取总RNA时，参照Invitrogen公司的Trizol试剂完成。在1%普通琼脂糖凝胶电泳上将总RNA分离出来，经过一定的分析，对总RNA的质量以及浓度进行判断。将符合要求的总RNA置于-80 ℃的环境条件下保存备用。

1.3cDNA第一链的合成

参照MBI公司的反转录系统的操作手册进行cDNA第一链的合成。取总RNA 2 μg置于DEPC-H2O中进行稀释，总体积调至12 μL，在逆转录酶的作用下于PCR扩增仪上保温1 h，温度控制在 42 ℃下即可；再在70 ℃下保温10 min，最后置于-20 ℃中保存备用。

1.4Quantitative Real-time PCR分析

以水稻18s rRNA作为内参，进行实时荧光定量PCR试验。20 μL PCR反应体系包括：10 μL 2× SYBR Green supermix reagent（包括反应缓冲液，dNTPs，SYBR Green染料），1.0 μL cDNA模板，20 nmol/L 基因特异引物，8 μL dd H2O。其中，用于该Real-time PCR分析的引物序列见表1。

1.5OsSRMYB1基因的生物信息学分析

参考Gramene数据库中的OsSRMYB1基因序列信息（LOC_Os12g03150.1）[8]，根据Primer Premier 5对引物OsSR MYB1-F（5′-GAACTATAGCTAGCCAAGTAGCCATG-3′）及OsSRMYB1-R（5′-GTTCTTGATGTCGTTGTCGGTG-3′）进行设计，模板选择水稻耐旱品种韭菜青cDNA，通过PCR对 OsSRMYB1基因的全长进行扩增，将其与pMD18-T载体进行连接并进行序列的测定。利用SMART网站（http：//smart.embl-heidelberg.de/）对获得的序列进行蛋白序列结构域进行分析。利用Rice oligonucleotide array database分析其在水稻不同组织中的表达。此外，利用genevestigator数据库分析其在不同胁迫下的表达情况以及其共表达基因。运用ClustalX与MEGA 4软件对OsSRMYB1进行多重序列比对与进化树构建。

2结果与分析

2.1OsSRMYB1的克隆及蛋白特性分析

以韭菜青cDNA为模板，通过PCR扩增获得OsSRMYB1基因全长并进行测序及序列分析，结果表明OsSRMYB1的ORF长度为1 599 bp，蛋白产物由311个氨基酸构成，分子量为34.06 KDa，等电点为-3.0。利用SMART（http：//smart.embl-heidelberg.de/）分析该蛋白的结构域，结果表明该蛋白包含SANT结构域（图1），为MYB家族蛋白。

2.2OsSRMYB1与其他非生物胁迫相关MYB类锌指蛋白的序列比对与进化树构建

选取非生物胁迫相关MYB类锌指蛋白Atmyb102、Atmyb2、GmMYB92、GmMYB76和OsSRMYB1，利用ClustalX与MEGA4软件进行序列比对及进化分析。由图2、图3可知，OsSRMYB1与其他4种MYB类锌指蛋白的氨基酸序列显著相似，特别是在其保守结构域内氨基酸序列高度保守。

2.3OsSRMYB1在不同组织及各种处理条件下的表达

利用Rice oligonucleotide array database，分析OsSRMYB1在水稻不同组织中的表达，结果分析表明OsSRMYB1基因在根、茎、叶片、叶鞘、穗等不同组织中均有表达（图4），其在叶中表达水平较高。

利用Gene vestigator数据库分析OsSRMYB1在不同胁迫下的表达情况，结果表明OsSRMYB1的表达受非生物胁迫影响，说明OsSRMYB1可能参与非生物胁迫响应。为了进一步分析OsSRMYB1在非生物胁迫中的功能，利用Real-time PCR分析了OsSRMYB11在H2O2、20% PEG、低温（4 ℃）及ABA处理下的表达（图5）。由表5可知，OsSRMYB1表达受H2O2诱导，而在20% PEG处理下其表达受抑制，表明OsSRMYB1可能参与了干旱、氧化胁迫等非生物胁迫的响应。

2.4OsSRMYB1的共表达与共调节基因分析

利用Genevestigator软件对OsSRMYB1可能的共表达及共调节基因进行分析，结果如图6、图7所示。OsSRMYB1的共表达基因为LOC_Os09g37050，编码RING-H2锌指蛋白，根据genevestigator分析该基因受NAA、GA3诱导。OsSRMYB1的共调节基因为LOC_Os02g44320，编码蛋白酶抑制剂蛋白，根据genevestigator分析该基因受冷害、H2O2诱导。

3结论与讨论

现有的研究表明，水稻中有多个基因家族参与非生物胁迫的应答，如GT转录因子家族[9]、TIFY基因家族[10]、BURP基因家族[11]、类BRX基因家族[12]等。OsSRMYB1为MYB类锌指蛋白，已有研究结果表明MYB类锌指蛋白亦可能参与非生物胁迫响应，如大豆GmMYB92、GmMYB76 及拟南芥Atmyb102、Atmyb2蛋白。研究表明 OsSRMYB1是一种在细胞内普遍存在且大量表达的多聚体核糖体蛋白质，在基因表达、抗逆响应中起重要作用。在组织表达分析中OsSRMYB1在新叶与幼穗中含量较高，表明OsSRMYB1可能在主要在分生组织中表达。

本研究克隆了OsSRMYB1基因，并通过氨基酸序列比对、蛋白结构域分析、基因表达特性等分析表明OsSRMYB1可能参与非生物胁迫响应，为进一步深入分析OsSRMYB1的生物学功能提供基础。与大多数已经报道的植物MYB类转录因子不同，本研究发现的OsSRMYB1受渗透胁迫的负调节，表明该基因可能在植物响应非生物胁迫过程中发挥了负向调控的作用。进一步将通过转基因技术获得过量和RNA干涉抑制表达OsSRMYB1基因的水稻转基因植物，深入研究其参与的非生物胁迫应答机制。

4参考文献

[1] 吴春霞.植物MYB基因研究进展[J].安徽农业科学，2009，37（20）：（下转第13页）

（上接第11页）

9372-9374.

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[3] 陈清汤，浩茹，董晓莉，等.植物Myb转录因子的研究进展[J].基因组学与应用生物学，2009，28（2）：365-372.

[4] 蔡新忠，徐幼平，楼健.番茄MYB基因片段的克隆及在过敏性反应时的表达[J].园艺学报，2003，30（5）：589-591.

[5] URAO T，NOJI M，YAMAGUCHI-SHINOZAKI K，et al.A transcriptional activation domain of ATMYB2，a drought-inducible Arabidopsis Myb-related protein[J].Plant J，1996，10（6）：1145-1148.

[6] DENEKAMP M，SMEEKENS SC.Integration of wounding and osmotic stress signals determines the expression of the AtMYB102 transcription factor gene[J].Plant Physiol，2003，132（3）：1415-1423.

[7] YOSHIDA S，FORNO D A，COCK J H，et al.Laboratory manual for physio-logical studies of rice（Third edition）[M].Phhilippines：The intern-ationgal Rice research Insitutude，1976.

[8] 吴家胜，赵彦宏，汪旭升.粳稻MYB蛋白家族的生物信息学分析[J].华南农业大学学报，2009，30（4）：43-47.

[9] FANG Y，XIE K，HOU X，et al.Systematic analysis of GT factor family of rice reveals a genes involved in stress and phytohormone responses in rice[J].Mol Genet Genomics，2010，283（2）：157-169.

[10] YE H，DU H，TANG N，et al.Identification and expression profiling ana-lysis of TIFY family genes involved in stress and phytohormone respon-ses in rice[J].Plant Mol Biol，2009，71（3）：291-305.

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[12] LIU J，LIANG D，SONG Y，et al.Systematic identification and expression analysis of BREVISRADIX-like homologous genes in rice[J].Plant Sci，2009，178（2）：183-191.

1.5OsSRMYB1基因的生物信息学分析

参考Gramene数据库中的OsSRMYB1基因序列信息（LOC_Os12g03150.1）[8]，根据Primer Premier 5对引物OsSR MYB1-F（5′-GAACTATAGCTAGCCAAGTAGCCATG-3′）及OsSRMYB1-R（5′-GTTCTTGATGTCGTTGTCGGTG-3′）进行设计，模板选择水稻耐旱品种韭菜青cDNA，通过PCR对 OsSRMYB1基因的全长进行扩增，将其与pMD18-T载体进行连接并进行序列的测定。利用SMART网站（http：//smart.embl-heidelberg.de/）对获得的序列进行蛋白序列结构域进行分析。利用Rice oligonucleotide array database分析其在水稻不同组织中的表达。此外，利用genevestigator数据库分析其在不同胁迫下的表达情况以及其共表达基因。运用ClustalX与MEGA 4软件对OsSRMYB1进行多重序列比对与进化树构建。

2结果与分析

2.1OsSRMYB1的克隆及蛋白特性分析

以韭菜青cDNA为模板，通过PCR扩增获得OsSRMYB1基因全长并进行测序及序列分析，结果表明OsSRMYB1的ORF长度为1 599 bp，蛋白产物由311个氨基酸构成，分子量为34.06 KDa，等电点为-3.0。利用SMART（http：//smart.embl-heidelberg.de/）分析该蛋白的结构域，结果表明该蛋白包含SANT结构域（图1），为MYB家族蛋白。

2.2OsSRMYB1与其他非生物胁迫相关MYB类锌指蛋白的序列比对与进化树构建

选取非生物胁迫相关MYB类锌指蛋白Atmyb102、Atmyb2、GmMYB92、GmMYB76和OsSRMYB1，利用ClustalX与MEGA4软件进行序列比对及进化分析。由图2、图3可知，OsSRMYB1与其他4种MYB类锌指蛋白的氨基酸序列显著相似，特别是在其保守结构域内氨基酸序列高度保守。

2.3OsSRMYB1在不同组织及各种处理条件下的表达

利用Rice oligonucleotide array database，分析OsSRMYB1在水稻不同组织中的表达，结果分析表明OsSRMYB1基因在根、茎、叶片、叶鞘、穗等不同组织中均有表达（图4），其在叶中表达水平较高。

利用Gene vestigator数据库分析OsSRMYB1在不同胁迫下的表达情况，结果表明OsSRMYB1的表达受非生物胁迫影响，说明OsSRMYB1可能参与非生物胁迫响应。为了进一步分析OsSRMYB1在非生物胁迫中的功能，利用Real-time PCR分析了OsSRMYB11在H2O2、20% PEG、低温（4 ℃）及ABA处理下的表达（图5）。由表5可知，OsSRMYB1表达受H2O2诱导，而在20% PEG处理下其表达受抑制，表明OsSRMYB1可能参与了干旱、氧化胁迫等非生物胁迫的响应。

2.4OsSRMYB1的共表达与共调节基因分析

利用Genevestigator软件对OsSRMYB1可能的共表达及共调节基因进行分析，结果如图6、图7所示。OsSRMYB1的共表达基因为LOC_Os09g37050，编码RING-H2锌指蛋白，根据genevestigator分析该基因受NAA、GA3诱导。OsSRMYB1的共调节基因为LOC_Os02g44320，编码蛋白酶抑制剂蛋白，根据genevestigator分析该基因受冷害、H2O2诱导。

3结论与讨论

现有的研究表明，水稻中有多个基因家族参与非生物胁迫的应答，如GT转录因子家族[9]、TIFY基因家族[10]、BURP基因家族[11]、类BRX基因家族[12]等。OsSRMYB1为MYB类锌指蛋白，已有研究结果表明MYB类锌指蛋白亦可能参与非生物胁迫响应，如大豆GmMYB92、GmMYB76 及拟南芥Atmyb102、Atmyb2蛋白。研究表明 OsSRMYB1是一种在细胞内普遍存在且大量表达的多聚体核糖体蛋白质，在基因表达、抗逆响应中起重要作用。在组织表达分析中OsSRMYB1在新叶与幼穗中含量较高，表明OsSRMYB1可能在主要在分生组织中表达。

本研究克隆了OsSRMYB1基因，并通过氨基酸序列比对、蛋白结构域分析、基因表达特性等分析表明OsSRMYB1可能参与非生物胁迫响应，为进一步深入分析OsSRMYB1的生物学功能提供基础。与大多数已经报道的植物MYB类转录因子不同，本研究发现的OsSRMYB1受渗透胁迫的负调节，表明该基因可能在植物响应非生物胁迫过程中发挥了负向调控的作用。进一步将通过转基因技术获得过量和RNA干涉抑制表达OsSRMYB1基因的水稻转基因植物，深入研究其参与的非生物胁迫应答机制。

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1.5OsSRMYB1基因的生物信息学分析

参考Gramene数据库中的OsSRMYB1基因序列信息（LOC_Os12g03150.1）[8]，根据Primer Premier 5对引物OsSR MYB1-F（5′-GAACTATAGCTAGCCAAGTAGCCATG-3′）及OsSRMYB1-R（5′-GTTCTTGATGTCGTTGTCGGTG-3′）进行设计，模板选择水稻耐旱品种韭菜青cDNA，通过PCR对 OsSRMYB1基因的全长进行扩增，将其与pMD18-T载体进行连接并进行序列的测定。利用SMART网站（http：//smart.embl-heidelberg.de/）对获得的序列进行蛋白序列结构域进行分析。利用Rice oligonucleotide array database分析其在水稻不同组织中的表达。此外，利用genevestigator数据库分析其在不同胁迫下的表达情况以及其共表达基因。运用ClustalX与MEGA 4软件对OsSRMYB1进行多重序列比对与进化树构建。

2结果与分析

2.1OsSRMYB1的克隆及蛋白特性分析

以韭菜青cDNA为模板，通过PCR扩增获得OsSRMYB1基因全长并进行测序及序列分析，结果表明OsSRMYB1的ORF长度为1 599 bp，蛋白产物由311个氨基酸构成，分子量为34.06 KDa，等电点为-3.0。利用SMART（http：//smart.embl-heidelberg.de/）分析该蛋白的结构域，结果表明该蛋白包含SANT结构域（图1），为MYB家族蛋白。

2.2OsSRMYB1与其他非生物胁迫相关MYB类锌指蛋白的序列比对与进化树构建

选取非生物胁迫相关MYB类锌指蛋白Atmyb102、Atmyb2、GmMYB92、GmMYB76和OsSRMYB1，利用ClustalX与MEGA4软件进行序列比对及进化分析。由图2、图3可知，OsSRMYB1与其他4种MYB类锌指蛋白的氨基酸序列显著相似，特别是在其保守结构域内氨基酸序列高度保守。

2.3OsSRMYB1在不同组织及各种处理条件下的表达

利用Rice oligonucleotide array database，分析OsSRMYB1在水稻不同组织中的表达，结果分析表明OsSRMYB1基因在根、茎、叶片、叶鞘、穗等不同组织中均有表达（图4），其在叶中表达水平较高。

利用Gene vestigator数据库分析OsSRMYB1在不同胁迫下的表达情况，结果表明OsSRMYB1的表达受非生物胁迫影响，说明OsSRMYB1可能参与非生物胁迫响应。为了进一步分析OsSRMYB1在非生物胁迫中的功能，利用Real-time PCR分析了OsSRMYB11在H2O2、20% PEG、低温（4 ℃）及ABA处理下的表达（图5）。由表5可知，OsSRMYB1表达受H2O2诱导，而在20% PEG处理下其表达受抑制，表明OsSRMYB1可能参与了干旱、氧化胁迫等非生物胁迫的响应。

2.4OsSRMYB1的共表达与共调节基因分析

利用Genevestigator软件对OsSRMYB1可能的共表达及共调节基因进行分析，结果如图6、图7所示。OsSRMYB1的共表达基因为LOC_Os09g37050，编码RING-H2锌指蛋白，根据genevestigator分析该基因受NAA、GA3诱导。OsSRMYB1的共调节基因为LOC_Os02g44320，编码蛋白酶抑制剂蛋白，根据genevestigator分析该基因受冷害、H2O2诱导。

3结论与讨论

现有的研究表明，水稻中有多个基因家族参与非生物胁迫的应答，如GT转录因子家族[9]、TIFY基因家族[10]、BURP基因家族[11]、类BRX基因家族[12]等。OsSRMYB1为MYB类锌指蛋白，已有研究结果表明MYB类锌指蛋白亦可能参与非生物胁迫响应，如大豆GmMYB92、GmMYB76 及拟南芥Atmyb102、Atmyb2蛋白。研究表明 OsSRMYB1是一种在细胞内普遍存在且大量表达的多聚体核糖体蛋白质，在基因表达、抗逆响应中起重要作用。在组织表达分析中OsSRMYB1在新叶与幼穗中含量较高，表明OsSRMYB1可能在主要在分生组织中表达。

本研究克隆了OsSRMYB1基因，并通过氨基酸序列比对、蛋白结构域分析、基因表达特性等分析表明OsSRMYB1可能参与非生物胁迫响应，为进一步深入分析OsSRMYB1的生物学功能提供基础。与大多数已经报道的植物MYB类转录因子不同，本研究发现的OsSRMYB1受渗透胁迫的负调节，表明该基因可能在植物响应非生物胁迫过程中发挥了负向调控的作用。进一步将通过转基因技术获得过量和RNA干涉抑制表达OsSRMYB1基因的水稻转基因植物，深入研究其参与的非生物胁迫应答机制。

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