心脏氧化还原系统对钠钙处理蛋白的调控机制

刘衍恭 刘 刚 王 普 郑明奇

心脏氧化还原系统对钠钙处理蛋白的调控机制

刘衍恭 刘 刚 王 普 郑明奇△

氧化应激引起的心脏收缩功能障碍和心律失常均源于细胞内外钠钙离子稳态失衡,其潜在的细胞内信号调控机制除了经典途径，如通过调控蛋白激酶A、蛋白激酶C和钙离子∕钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ等蛋白激酶使之活化外；近来愈来愈多的证据显示氧化应激时活性氧自由基也能够直接氧化这些激酶或者钠钙离子转运蛋白和离子通道，从而改变其作用，导致心律失常发生。

氧化应激；钠钙处理；活性氧自由基；氧化还原系统；心律失常

心脏的收缩功能障碍和心律失常均源于细胞内钠钙离子处理障碍[1]。其经典的调控机制包括许多影响钠钙调控的蛋白信号途径，如应激活化的蛋白激酶，包括蛋白激酶A （PKA）、蛋白激酶C（PKC）和钙离子∕钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ（CaMKⅡ）。同时，愈来愈多的证据显示活性氧自由基（ROS）能够直接氧化这些激酶，从而改变其作用。当心脏处于疾患状态时，ROS生成增多，一方面激活丝氨酸∕苏氨酸激酶，使细胞内钙离子稳态失衡；另一方面通过氧化和激活离子通道和转运蛋白，如电压门控钠通道、Na+∕K+-ATP酶（NKA）、钠钙交换蛋白（NCX）、L型钙离子通道、兰尼碱受体（RyR2）及肌质网钙离子ATP酶（SERCA2a），引起钠钙失衡，促进心律失常发生。本文就细胞内钠钙处理蛋白的氧化还原调控机制综述如下。

1 心脏的氧化还原系统

心脏的氧化还原系统是由生成ROS的蛋白系统和抗氧化的蛋白系统组成的微妙平衡。

1.1 心脏的ROS来源和抗氧化能力 ROS的细胞内来源包括线粒体、NADPH氧化酶、黄嘌呤氧化酶和非偶联的一氧化氮合成酶（NOS）。生理条件下，线粒体内氧化磷酸化可产生少量超氧化物（O2-），其又可以被超氧化物歧化酶（SOD）失活变成H2O2。O2-由于其高活性只能扩散几个纳米的有限距离，而H2O2的低活性可以允许其扩散至细胞膜。H2O2自身可被谷胱甘肽过氧化酶、过氧化氢酶和硫氧还蛋白（Trx）系统还原成H2O。谷胱甘肽过氧化酶大量存在于线粒体和胞质中，其活性需要谷胱甘肽的存在，而谷胱甘肽是胞质内主要的氧化还原缓冲物质。还原型与氧化型谷胱甘肽的比率通常大于10，但在病理条件下会显著降低[2]。当超氧化物增加时，随之产生大量的H2O2使细胞内的抗氧化能力大大削弱，同时也可以产生大量高反应性的OH-自由基或者过氧化亚硝酸基（ONOO-）[3]。

除了在线粒体可以大量生成O2-外，在心肌细胞因富含NADPH氧化酶（Nox2和Nox4）也能产生O2-。研究显示在心脏氧化应激（机械张力、内皮素-1、血管紧张素Ⅱ）的条件下，Nox活性是增加的，且与线粒体内的ROS产物密切相关[4]。Nox依存的ROS产生在线粒体内能够以ROS诱发ROS释放的正反馈方式大量扩增。虽然目前Nox4的作用还不太清楚，但越来越多的证据显示Nox4的上调控及其大量转运至线粒体内，能显著增加ROS的产生，加重心肌功能障碍和心律失常发生。但也有研究显示基因敲除Nox能够使心脏功能障碍进一步加重，这可能是Nox4在血管形成中具有有益作用[5]，但内在机制尚不清楚。

ROS的第3种来源是黄嘌呤氧化酶，在心功能不全时其活性和表达会增加。此外，还有NOS，在氧化应激时其结构会变得不稳定，产生ROS（NOS的非偶联作用）。这种作用在压力超负荷时影响心脏重构。特别注意的是，内皮型NOS （eNOS）常和L型钙离子通道共存于细胞膜小凹中，而神经型NOS（nNOS）则和RyR2共存于肌浆网上。这暗示了NOS 在ROS依存性的钙离子处理中扮演着重要的角色[6]。由于ROS的半衰期极短，对离子通道蛋白和转运蛋白的作用因ROS产生的来源和部位不同而有差别。

1.2 蛋白的氧化还原调控 ROS氧化半胱氨酸的巯基团（SH-），生成二硫基团，从而影响蛋白的三级结构和四级结构，改变通道蛋白的性状和功能。研究已经显示许多钙调节蛋白在生理或病理条件下受到ROS依存性的氧化而发生功能变化[7]。

2 丝氨酸/苏氨酸（Ser/Thr）激酶的氧化还原调控

高活性的ROS在细胞内扩散距离非常有限。因此内源性ROS只能影响邻近的靶目标，产生的作用很局限。另一方面，ROS能够对心肌细胞产生广泛的影响，对这种矛盾的一种解释是ROS依存的Ser∕Thr的活化作用所致，使这些酶能够位移，磷酸化钙调节蛋白，最终导致诸多活性改变。

2.1 CaMKⅡ CaMKⅡ对细胞内钙离子和兴奋收缩偶联有重要的调控作用。CaMKⅡ是一种Ser∕Thr激酶，在心脏组织大量表达。CaMKⅡ能磷酸化多种钙调节蛋白，包括L型钙通道、RyR2和受磷蛋白（PLN）[8]。另外，CaMKⅡ能磷酸化心肌钠通道，增加晚钠内流，延长动作电位间期（APD）。

典型CaMKⅡ活化是钙离子依赖性的。钙离子先共价结合于钙调蛋白（Ca-CaM），然后一起结合到CaMKⅡ的调控区域，消除调控区域对催化区域的自动抑制作用，使靶蛋白磷酸化。激活后，即使Ca-CaM与调控区域分离，Ser286或287亚单位自身也可发生磷酸化，继续消除调控区域对催化区域的抑制作用。因此，Ser286自身磷酸化能够产生持续的自发活性。通过整合胞内快速瞬间钙浓度的变化，Thr286自身磷酸化是CaMKⅡ对钙的记忆。

另一种新颖的非钙依赖性CaMKⅡ的活化机制阐述了ROS氧化调控区域的蛋氨酸281∕282，产生与Thr286自身磷酸化相似的活化模式(非Ca-CaM依赖活化)[9]。例如，通过血管紧张素Ⅱ与心肌细胞上的受体结合刺激NADPH氧化酶2可产生这种形式的活化作用。蛋氨酸281∕282的氧化是一种可逆过程。蛋氨酸硫化物还原酶A可使被氧化的蛋氨酸还原。在病理生理学上，CaMKⅡ被氧化与窦房结功能障碍和醛固酮诱导的心脏损伤有关。

2.2 PKA 儿茶酚胺结合到G蛋白偶联的β受体，激活腺苷酸环化酶，增加细胞内环磷酸腺苷（cAMP），进而活化PKA。PKA有2种形式：PKAⅠ和PKAⅡ，均为包含2个催化亚基和调节亚基的四聚体。调节亚基与PKA锚定蛋白（AKAP）结合，使PKA移向它的底物蛋白。两分子的cAMP与各自的调节亚基结合使PKA产生活化作用，有利于催化亚基和调节亚基的分离，导致底物磷酸化。众所周知，PKA能够使一些钙调节蛋白磷酸化，包括RyR2、L型钙通道和PLN[10]。另外PKA使肌钙蛋白Ⅰ磷酸化，能够调节肌丝对钙离子的敏感性。

PKA调节亚基包括2种亚型：RⅠ型和RⅡ型。RⅠ型存在于胞液中，而RⅡ型位于细胞内膜，其靶目标是AKAP。肽类底物使RⅠ型在低浓度下活化，生理浓度的cAMP通过竞争取代RⅠ型亚基。RⅡ型不具有这种底物诱导敏感性的作用。RⅠ型易被ROS氧化，将2个调节亚基之间的半胱氨酸17和38的氧化形成二硫化物，使PKA全酶复合体分离。RⅠ型的移位（从细胞液转移到细胞膜和肌丝）和激活引起细胞收缩性增加，而无需cAMP增加。被氧化的RⅠ型的移位对活化有利，是因为它更易于与底物结合。

2.3 PKC 根据PKC的活化特征，将12种PKC同工酶分为3类：传统的PKC同工酶（α、βⅠ、βⅡ和γ），可被钙离子和甘油二酯（DAG）活化；新型的同工酶(δ、ε、θ和η）和不典型的同工酶（ξ和λ）是非钙离子依赖性的，可被脂类活化。PKC由N末端调节亚基和C末端催化亚基组成。PKC失活时，调节亚基与催化亚基结合。活化因子（DAG和钙离子）致PKC构象发生改变，引起酶自身抑制解除和活化开始，甚至能促使PKC位移至胞膜进一步增强其活化效果，然后，活化的PKC与细胞内受体蛋白结合发挥作用。PKC上的结合位点是由底物的结合位点决定的，而DAG能进一步增加结合位点数目。这些受体蛋白被称为活化激酶C受体，在诱导活化PKC位移中起重要作用。

PKC活化的效果是复杂多样的，特别是几种同工酶同时活化时，其效果会相互依存，交叉叠加。细胞内各个同工酶的活性依赖于它们的表达水平、基质位置和磷酸化状态。因种属和细胞类型的差异，PKC同工酶的作用也各不相同。这也许可以解释使用基因敲除法敲除一种PKC同工酶后，经常会表现出不相一致的结果。但总体来说，G蛋白偶联受体激动剂（异丙肾上腺素和血管紧张素Ⅱ）和机械牵张都可以通过激活PKC使心肌肥大。在心肌肥厚的在体模型中，PKCα和PKCβ表达上调，PKCε不仅表达上调而且优先活化，而PKCδ、λ或ξ表达水平并没有变化[11]。另外，在心肌缺血的预适应中PKCδ和PKCε作用相反。

PKC可调控兴奋收缩偶联。PKCα能够增强蛋白磷酸酶1的活性，引起PLN脱磷化和降低SERCA2a活性。PKCα或PKCβ能够磷酸化肌钙蛋白I、肌钙蛋白T、肌联蛋白和肌球蛋白结合蛋白C，致使肌丝对钙的敏感性下降。同时PKCα、PKCβⅠ、βⅡ和PKCγ能够使L型钙通道的α1c亚基磷酸化。

研究显示氧化应激也能激活PKC。高浓度的ROS （5 mmol∕L H2O2）能同时氧化PKC的催化亚基和调控亚基，引起激酶不可逆性失活。而低浓度ROS（50 mmol∕L H2O2）仅氧化PKC调控亚基，产生非钙离子和磷脂依赖性的活化[12]。这种新型病理生理相关的氧化还原依赖的PKC激活机制目前不太清楚。

3 钠钙处理蛋白的氧化还原调控

ROS的蓄积可以引起细胞内钠离子和钙离子超载，同时细胞内钠超载会极大增强线粒体ROS的产生。这种正反馈环极大地加重了ROS所导致的损害。细胞内钠钙的稳态是紧密相关的，改变钠处理蛋白不仅改变细胞内钠含量，也能影响细胞内钙含量及心肌收缩性。

3.1 电压门控钠通道 心肌钠通道由主孔道α亚基(Nav1.5)及调节性β亚基组成。Nav1.5包含1个蛋氨酸残基，其能被ROS所氧化，降低钠通道开放度。ROS也会降低钠通道的利用度，并延长通道从失活状态的恢复时间，引起钠通道失活曲线负性偏移,但ROS并没有改变钠通道的激活特性。

最近一种新型的钠通道电流（晚钠电流）门控模式越来越受到关注，其也可由ROS来激活。峰钠电流只持续极短时间（大约10 ms），但晚钠电流可以持续数百毫秒。尽管晚钠电流的幅度很小（约仅为峰电流的1％），由于其持续特性，仍可以使相当的钠离子通过这种方式进入细胞内。这表明在病理状态下，晚钠电流也是细胞内钠离子的重要调控者。研究显示ROS可增加细胞内钠离子含量，延长APD，导致早期复极（EADs），这些可能与ROS增强晚钠电流有关[13]。

除了ROS直接氧化Nav1.5蛋白外，脂质环境的改变或ROS诱导PKA、PKC和CaMKⅡ激活都可能与ROS对心脏钠通道调控相关。Nav1.5 a亚基可被PKA、PKC及CaMKⅡ磷酸化。CaMKⅡ磷酸化位点在Ser571∕516及Thr594，由于磷酸化增强了钠通道失活状态，致使电压依存性失活曲线负向偏移。虽然许多相关的磷酸化位点还不清楚，但已明确的是CaMKⅡ能够增大晚钠电流，使细胞内钠蓄积、APD延长及心律失常发生。其潜在机制可能与上述ROS对钠通道调控作用相关。而且，CaMKⅡ基因剔除小鼠中未观察到ROS所引发的晚钠电流改变，暗示CaMKⅡ可能在钠通道氧化还原调控中的重要地位[14]。PKA及PKC均能够影响心肌钠通道。Nav1.5的Ⅰ～Ⅱ亚基连接环中有2个丝氨酸残基（Ser526∕529）均可以被PKA磷酸化。PKA介导的Nav1.5磷酸化，可以加速通道移动至细胞膜，进而增强峰值钠电流密度，但并不改变通道的失活动力学。PKC也能调控钠通道电流。在PKC被抑制前提下，H2O2减慢钠通道失活的作用消失。在异源表达系统（大鼠及人Nav1.5），PKC的激活并没有改变钠通道的失活状态，使人质疑PKC在钠通道调控中的作用。目前最统一的认识是，PKC可磷酸化心肌钠通道Ⅲ～Ⅳ连接处的Ser1505，减小峰值钠电流密度。尽管PKA和PKC都可以或多或少地影响钠通道电流密度，这主要通过改变细胞膜上功能通道的数目，而不是对钠通道门控属性的调控（如激活及失活的过程）。因此，ROS引起PKA及PKC的激活并不能解释ROS对钠通道门控的调控，更可能的是线粒体产生的ROS（由细胞质NADH衍生）通过PKC途径降低峰值钠电流密度。

3.2 NKA 生理状态下，细胞内钠离子很大程度受NKA调控。兔心室细胞暴露于H2O2后，即使出现ROS介导的钠电流增强16倍，细胞内钠离子浓度也没有明显改变，这正是由于NKA极大地被激活[14]。尽管ROS诱导的细胞内钠离子增加的具体机制还不清楚，但ROS本身就具有较强的NKA抑制能力。除了脂质环境的改变外，也有可能是ROS对NKA的直接氧化作用。因为NKA的β亚基含有一个巯基基团，而这又是催化活性的必需基团。

对NKA的氧化还原调控，除了直接氧化作用，也可通过PKA及PKC途径。磷酸神经膜（PLM）通过降低NKA与钠的亲和力，抑制NKA的活性。而PKA或PKC能磷酸化PLM，使其催化亚基分离而增强NKA作用。因为ROS的实际作用是抑制NKA的活性，而ROS激活PKA及PKC会导致PLM磷酸化、解离，并增强NKA的功能，这一矛盾的推断提示PKA和PKC不太可能参与ROS对NKA的调控[14]。如果NKA大量失活，将会引起细胞内钠激增。除了钠通道引起钠内流增加，通过增强钠-质子交换机制加速钠内流也是有可能的，但具体的病理机制还未知。细胞内的钠与细胞内的钙紧密相关。心肌NCX的活性是膜电位及钠钙跨膜梯度的功能基础。伴随动作电位时程延长，细胞内的钠增加，这样通过NCX引起钙外流减少（前向型模式），和（或）钙内流减少（逆向型模式），最终会导致细胞内钙的聚集。事实上，在细胞内的钠增多状况下，通过NCX的钙内流会更多[14]。

3.3 NCX 对心肌NCX而言，不同区域的半胱氨酸残基间的二硫键可能是维持其功能的重要部分。ROS具有激活NCX的作用，但是其激活效果与ROS的量和来源并没有表现出一致性。对于Ser∕Thr激酶在NCX调控中的作用有很多争论。PKA及PKC的催化基团并不能改变心肌NCX功能，暗示了NCX也许不受激酶的调控。另一方面，有报道表明，NCX的细胞内环可以被PKA及PKC磷酸化，继而增加NCX的活性，这也许是ROS增强NCX的部分原因[15]。在细胞内钠增加条件下，ROS对NCX刺激引起细胞内钙过载。事实上，在心衰中过表达的NCX增强了ROS介导的细胞损伤。而抑制NCX的药物，可以抑制钙内流，从而减少了ROS介导的钙过载，消除细胞损伤[14]。

3.4 电压门控L型钙通道 心脏L型钙通道的α1c亚基包含10个以上的半胱氨酸残基，因此理论上能够被氧化还原所调控。有报道表明，在异源表达系统（HEK293）或心肌细胞，巯基氧化剂或ROS能够不可逆地减少钙电流（ICa）。但另外一些报道表明，巯基氧化剂或ROS能够增强ICa[16]。矛盾的原因可能是CaMKⅡ、PKA、PKC能够通过磷酸化激活ICa，而这3种激酶又由ROS介导氧化∕激活。PKA已经被证明可以磷酸化L型钙通道α1c亚基的一些位点，其中包括Ser1928[17]。然而钙电流调控的关键磷酸化位点仍然未知，因为对α1c亚基及附属的β亚基的磷酸化都能增强ICa。因此，ROS能够通过激活丝氨酸激酶增大ICa，也能通过直接氧化作用减小ICa。这最终的效果依赖于ROS的来源及剂量。另外有报道证明H2O2所引发的钙超载是因为细胞内钙库释放和通过NCX流入所致，并非钙通道激活[14]。ROS对α1c亚基最可能的作用是直接氧化还原调控。

3.5 RyR2 RyR由4个亚基组成，在心脏主要为RyR2型。每一亚基都含有89个半胱氨酸，其中有21个为游离态。巯基氧化物（如H2O2）在每个亚基上至少需氧化7个巯基后，才能激活RyR释放钙离子。因为RyR2含有多个磷酸化调控位点，能与Ca2+、Mg2+、ATP、CaM或调节蛋白（FKBP12.6）相互作用，因此氧化作用可能与这些调节因子有关。事实上，ROS诱导RyR钙释放增加的机制包括RyR对胞浆Ca2+及ATP的敏感性改变，RyR与triadin（调控RyR对细胞内Ca2+敏感性）的相互作用，干扰FKBP12.6的结合[18]。此外，低浓度ROS能够增加舒张期RyR钙释放（钙火花频率），而过高浓度的ROS则抑制钙火花频率。因此ROS诱导的RyR的调控与具体的氧化程度有很大关联。

ROS除了能直接氧化RyR半胱氨酸残基，也能通过激活Ser∕Thr激酶来增加RyR钙释放。众所周知，RyR2经CaMKⅡ及PKA磷酸化后增加舒张期钙渗漏。而这两种激酶都可以通过ROS氧化激活。因此，ROS对RyR2的部分作用很有可能是通过氧化CaMKⅡ及PKA完成的。

舒张期钙渗漏增加的一个后果就是减少了肌质网（SR）钙容量，尤其是在ROS降低SERCA功能的情况下[19]。已经证明ROS可以减少SR钙容量。这会导致暂时性钙缺乏及降低收缩力[14,19]。由于前向型NCX的快速激活，舒张期钙渗漏是延迟晚复极的主要因素。这种由ROS引发的钙火花频率的增加与晚复极的延迟及心律失常密切相关，尤其是在NCX已由ROS增强的状况下[14]。

3.6 SERCA SERCA2a及其抑制型调控蛋白PLN都可以受氧化还原调控修饰。SERCA2a含有25个半胱氨酸残基，其中只有1～2个残基对酶活性具有关键作用。巯基氧化物或ROS可以抑制心肌SERCA2a活性，部分原因可能是直接影响其ATP结合位点[20]。此外，CaMKⅡ（Thr17）及PKA （Ser16）可以磷酸化PLN，使PLN解离，激活SERCA。后者可能与ROS依赖的SERCA调控没有太大的关系，因为ROS只显示出抑制SERCA活性的功能，或许这与PKC介导的信号通路相关。与CaMKⅡ及PKA激活SERCA不同，PKC可降低SERCA的活性。心脏PKAα基因缺陷的小鼠表现为高收缩力，而PKAα基因过表达的小鼠表现为低收缩力，其内在的机制可能与PKAα介导蛋白激酶抑制剂-1（PPI-1）磷酸化有关，PPI-1激活后使PLN脱磷酸化。SERCA2a活性的减少可以导致SR钙容量的减少，并使钙火花幅度降低或消失[21]。

4 ROS相关的心律失常

细胞内钠钙处理蛋白的改变与心电不稳定性密切相关。ROS延长APD，引起EAD的机制，以前的研究认为是ROS增大ICa。近年研究显示选择性钠通道阻滞剂河豚毒素（TTX）可以逆转ROS的这种延长APD作用，主要是TTX抑制了ROS增强的晚钠电流。最近进一步证实，这种机制与氧化还原激活CaMKⅡ，增强晚钠电流有关，晚钠电流增加延长APD，易引起EAD[14]。同时ROS介导的ICa增加和Ito电流减少在这种电不稳定中也起着重要作用[22]。

ROS介导的细胞内钙超载和舒张期钙渗漏能使NCX内向电流增加，促使钙离子向细胞外转运，产生去极化电位，引起延迟后除极（DAD）。心肌暴露于ROS后，能显著地增加EAD和DAD，这种作用在CaMKⅡ基因敲除的小鼠显著减少[14]。因此，氧化还原对CaMKⅡ的调控在ROS介导的心律失常中起着重要的作用。

除ROS能致使钠钙处理蛋白调控障碍，ROS对线粒体ATP的影响也能增加心律失常的发生[23]。线粒体中ROS诱导ROS释放，使线粒体去极化；同时抑制ATP合成，使胞质KATP通道激活，导致APD缩短，延缓传导。在心脏不同区域，线粒体膜除极时间和空间不一致，易产生折返和致死性心律失常。

5 结论

ROS增强晚钠电流和减低NKA活性导致细胞内钠积蓄和动作电位延长，促使ROS介导NCX的激活使钙离子进入细胞内。另一方面，ROS增强了RyR2开放率，同SERCA功能障碍（肌浆网钙重吸收减低）一同引起舒张期钙渗漏增加。肌质网功能障碍并不能代偿重吸收由NCX转运至细胞内钙离子，这样共同显著提高了细胞内钙离子浓度，减少了SR钙火花频率，致使心肌收缩性减低、心律失常发生和细胞损伤。

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（2014-05-01收稿 2014-06-10修回）

（本文编辑 闫娟）

Redox Regulation of Cardiac Na and Ca Handling Protein

LIU Yangong,LIU Gang,WANG Pu,ZHENG Mingqi△
Department of Cardiology,the 1stHospital of Hebei Medical University,Shijiazhuang 050031,China△

E-mail:mzheng2020@163.com

Cardiac contractile dysfunction and arrhythmic genesis are resulted from disturbed intracellular Na+and Ca2+handling under condition of oxidation stress.Stress-induced intracellular signaling regulated mechanisms in which many activated stress kinases,such as cAMP-dependent protein kinase A,protein kinase C,Ca∕calmodulin-dependent protein kinaseⅡand classical pathways,are known to be involved.However,it is becoming increasingly evident that reactive oxygen species may directly oxidize these kinases,Na+and Ca2+channel protein and transporters,which lead to changing of intracellular Na+and Ca2+accumulation,and to trigger of arrhythmias.

oxidation stress;Na+and Ca2+handling;reactive oxygen species;redox system;arrhythmias

R331.8

A

10.3969∕j.issn.0253-9896.2014.10.024

国家自然科学基金资助项目（81100127）；中国博士后科学基金面上资助项目（2013M530120）；河北省医学科学研究重点课题项目(20130274)；河北省科技计划项目（13277720D）

河北医科大学第一医院心内1科（邮编050031）

△通讯作者 E-mail：mzheng2020@163.com