前列腺癌超声微泡介导药物及基因治疗研究进展

刘 芸 赵 云△ 刘朝奇 胡 兵

前列腺癌是男性高发的恶性肿瘤之一。常规去激素治疗前列腺癌后多在12～18个月内发展为雄激素非依赖性前列腺癌（androgen-independent prostate carcinoma，AIPC），目前临床上对AIPC缺乏有效的治疗方法。随着分子生物学和基因技术的发展，基因治疗显得极具优势。然而，同其他肿瘤的基因治疗一样，前列腺癌离体细胞或动物实验基因治疗效果不尽理想，主要原因之一是缺乏安全高效的活体内基因运送载体。目前常用的非病毒载体存在转染率低等问题，病毒载体虽转染效率高，却存在安全性低、免疫原性高、靶向性差等缺点。近年来，国内外学者研究发现，超声微泡造影剂可作为一种新型的体内基因转染载体，用于前列腺癌的治疗研究，并有望为前列腺癌患者提供一种安全、高效的治疗方法[1]。本文就载药微泡在前列腺癌治疗中的应用综述如下。

1 超声微泡造影剂

超声微泡造影剂因具有回波反射性而应用于组织增强显影,又因能促进质粒在细胞和组织中的转运，而被用作基因运载体。其主要由内充气体和外壳构成，内充气体现多采用低溶解度的气体，如氟碳气体C3F8、C4F10或氟硫气体SF6，其在血液中的循环时间及稳定性明显高于空气核心的纳米级超声微泡；外壳多由糖类、变性的白蛋白、磷脂、聚合物或上述物质混合而成[2]。

2 超声微泡的靶向性作用

超声微泡可成为理想的药物或基因载体的主要原因是，其可定向到达特定部位而发挥作用。超声微泡的这一特性被称为靶向性作用。而根据其实现靶向的机制和部位不同，可将其靶向作用分为被动型和主动型。被动型靶向是指通过机体本身的免疫－吞噬细胞在调理素的协同作用下实现对异物（超声微泡）的清除；主动型靶向是指通过对超声微泡的外壳进行特殊处理，如在其外壳表面装配具有靶向性识别的各种配体（如抗体、糖类、多肽类），此类配体能特异性识别并结合病变组织细胞所表达的受体，从而达到靶向显影，载药、载基因靶向治疗的目的[3]。

超声微泡靶向性作用是其作为载体应用于临床的基础，为提高超声微泡的靶向性，国内外学者做出了各方面的尝试。Maul等[4]提出了双重靶向的概念，在微泡上插入一个快速定位配体和一个稳定性好、亲和力高的缓慢定位配体,在提高微泡黏附率的同时，增强了微泡抗脱落的能力。Sun等[5]合成了阳离子超声微泡（cationic microbubble,CMB），其携AKT基因转染缺血性心肌病的能力较普通微泡提高了近70%，经其治疗后，心肌梗死范围明显缩小，心肌细胞凋亡率降低，心肌内微血管密度增加。Yan等[6]利用生物素－亲和素连接方式将紫杉醇与脂质微泡结合起来，制备了紫杉醇-脂质微泡。该微泡在超声辐照下可靶向作用于肿瘤，有效地促进了肿瘤细胞的凋亡，限制了肿瘤的生长。

3 超声微泡携药物治疗的作用机制

3.1 声孔效应 声孔效应是超声微泡靶向治疗的物理基础。微泡在超声激发下出现震荡或内爆，并伴随产生高速微束射流、巨大切应力和冲击波等，致使细胞膜的完整性遭到破坏。在细胞膜甚至核膜上产生直径约为50 nm暂时性、可逆性的小孔，此即声孔效应。这些小孔可以允许分子质量在10～3 000 ku的物质通过细胞膜或核膜。在高强度超声辐射或微泡浓度较高时，这种小孔可成变为永久性的小孔，使得细胞内外渗透压改变，最终导致细胞死亡，此即为致死性声孔效应[7]。

3.2 空化效应 细胞膜通透性改变是基因转染的前提。超声在辐照中所产生的空化效应和机械效应可增强细胞膜的通透性，尤以空化效应为主。空化效应分为稳态空化和瞬态空化。后者是一种强烈的生物效应，在增强基因的转染的同时，甚至会引起细胞凋亡、坏死。Bazan-Peregrino等[8]的研究显示，超声的空化效应可使毛细血管内皮细胞间隙增宽和细胞膜通透性增加，从而使得微泡或释放的基因能够进入血管壁及组织间隙，发挥靶向治疗作用。

3.3 其他作用 Meijering等[9]提出，超声辐射下微泡破裂，导致过氧化氢大量生成，同时引起邻近细胞膜Ca2+内流、Ca2+依赖性K+通道开放，从而致使局部膜电位发生超极化，该机制介导超声微泡通过内吞作用和胞饮作用进入细胞内。Tran等[10]研究结果显示，超声微泡破裂产生的压力可形成一种机械性刺激，活化特定通道(牵张激活通道)和非特异性离子通道，使外源性分子（如含转染基因或药物的微泡）进入细胞内而发挥作用。

4 超声微泡介导药物治疗前列腺癌的研究进展

4.1 超声微泡介导与肿瘤细胞凋亡 Li等[11]在超声引导下用磷脂微泡携带羟基喜树碱作用于肿瘤小鼠。Fan等[12]利用超声辐照下携载survivin siRNA的纳米级微泡治疗前列腺癌，通过基因沉默抑制survivin在前列腺癌C4细胞及DU-145细胞中的表达，而诱导细胞的凋亡，达到显著的抑癌效果。Kim等[13]发现，对前列腺癌小鼠进行超声微泡结合放射性治疗，肿瘤细胞凋亡率明显增加。

4.2 超声微泡介导与肿瘤新生血管的损伤 肿瘤的迅速生长依赖于从新生血管内获取足够多的营养。肿瘤新生血管内皮会表达大量的黏附分子受体、生长因子受体（如整合素αvβ3和血管内皮生长因子）等，它们在肿瘤毛细血管及细胞中表达，而在正常细胞中表达甚微，因此，其可作为微泡治疗肿瘤的良好靶点。Anderson等[14]将环状五肽cRGD（精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸）连接在微泡表面制成cRGD-MB，以靶向结合αvβ3整合素,与对照组相比，cRGD-MB组具有显著吸附αvβ3整合素的能力，靶向作用于肿瘤的能力更强。Negi⁃ shi等[15]从层黏连蛋白a1链中分离得到了含12个氨基酸的AG73多肽链，合成了AG73脂质超声微泡（AG73-Bubble li⁃posomes，AG73-BLs）,AG73-BLs能与肿瘤血管内皮中高表达的硫酸类肝素蛋白多糖（syndecan-2）特异性结合，从而实现定向黏附肿瘤血管内皮的作用,AG73-BLs组较未标记组或其他微泡修饰组，靶向性更强，且持续作用时间可达4 min。Hwang等[16]研究发现，超声微泡造影剂在低频超声辐照下会损伤肿瘤新生血管内皮，并激活内源性和外源性凝血，诱发血管内血栓形成，栓塞毛细血管，引起局部肿瘤组织缺血、坏死。

4.3 超声微泡介导与药物的运输 超声微泡在靶向治疗肿瘤独具优势主要体现在两个方面，一是高特异性(通过配体-受体结合)地将基因或药物运送至肿瘤部位，二是在特定参数的超声辐照可促进肿瘤细胞对化疗药物的摄取，这点在化疗中尤为重要。Jackson等[17]将超声参数设定为4 MHz和平均声强为32 W/cm2时，肿瘤细胞和血管内皮细胞对亲水性微泡造影剂（若丹明R123，亲水性阿霉素和甘露醇）和疏水性微泡造影剂（若丹明R6G和紫衫醇）的摄取率均升高，由纳米微粒封闭紫杉醇的吸收率近达100%。Bai等[18]将超声参数设定为21 kHz、声强为4.6 mW/cm2时，脂质微泡＋pEGFP+超声组中，pEGFP DNA对PC-3细胞的转染率达到了20.30%，其转染率为pEGFP直接转染组的81倍。Liu等[19]在对兔前列腺癌进行超声辐照下微泡治疗（microbubble-enhanced thera⁃peutic ultrasound，MEUS）后，注射伊文斯蓝（Evans blue，EB）和硝酸镧（lanthanum，La），并计算EB及La在肿瘤组织中的渗出率，以评估MEUS治疗前列腺癌的效果。结果显示，在激光扫描共聚焦显微镜（laser scanning confocal microscopy，LSCM)下EB渗出率增加，并广泛分布于微血管基质及腺上皮。透射电子显微镜（TEM）显示血管内皮细胞间的紧密连接被打开，并见La在基质和腺上皮分布。该实验表明MEUS可以提高前列腺癌的渗出率，并能打开血-前列腺癌屏障。

5 问题与展望

随着分子生物学的迅猛发展，超声微泡可通过各种修饰、装配，而成为介导前列腺癌基因治疗的主要工具。但目前这些研究大都处于临床前的动物实验阶段，在其进入临床试验之前仍需解决以下问题：（1）微泡制备技术及将药物、基因或配体连接至微泡上的技术尚不成熟。微泡携带基因或药物量有限，同时，微泡在血管内运输时因血液具有流动性与冲击性，导致微泡与受体接触时间短，靶向微泡-受体对形成数量不足，往往处于治疗阈值以下。（2）超声微泡爆裂时，除了能使血管内皮间隙增宽而促进基因转染外，还可引起血管内皮细胞损伤、血小板激活、血管内溶血等不良反应。（3）超声参数设定对于微泡的转染率有一定的影响，但仍未形成最优参数。

[1]Tinkov S,Bekeredjian R,Winter G,et al.Microbubbles as ultrasound triggered drug carriers[J].J Pharm Sci,2009,98(6):1935-1961.

[2]SheeranPS,DaytonPA.Phase-change contrast agents for imaging and therapy[J].Curr Pharm Des,2012,18(15):2152-2165.

[3]Cavalieri F,Zhou M,Ashokkumar M.The design of Multifunctional microbubbles for ultrasound image-guided cancer therapy[J].Curr Top Med Chem,2010,10(12):1198-1210.

[4]Maul TM,Dudgeon DD,Beste MT,et al.Optimization of ultrasound contrastagents with computational models to improve selection of li⁃gands and binding strength[J].Biotechnol Bioeng,2010,107:854-864.

[5] Sun L,Huang CW,Wu J,et al.The use of cationic microbubbles to improve ultrasound-targeted gene delivery to the ischemic myocar⁃dium[J].Biomaterials,2013,34(8):2107-2116.

[6]Yan F,Li L,Deng Z,et al.Paclitaxel-liposome-microbubble com⁃plexes as ultrasound-triggered therapeutic drug delivery carriers[J]. J Control Release,2013,166(3):246-255.

[7]Tinkov S,Bekeredjian R,Winter G,et al.Microbubbles as ultra⁃sound triggered drug carriers[J].J Pharm Sci,2009,98(6):1935-1961.

[8]Bazan-Peregrino M,Arvanitis CD,Rifai B,et al.Ultrasound-in⁃duced cavitation enhances the delivery and therapeutic efficacy of an oncolytic virus in an in vitro model[J].J Control Release,2012, 157(2):235-242.

[9]Meijering BD,Juffermans LJ,van Wamel A,et al.Ultrasound and microbubble-targeted delivery of macromolecules is regulated by induction of endocytosis and pore formation[J].Circ Res,2009,104 (5):679-687.

[10]Tran TA,Roger S,Le Guennec JY,et al．Effect of ultrasound-acti⁃vated microbubbles on the cell electrophysiological properties[J]．Ultrasound Med Biol,2007,33(1):158-163．

[11]Li P,Zheng Y,Ran H,et al.Ultrasound triggered drug release from 10-hydroxycam ptothecin-loaded phospholipid microbubbles for targeted tumor therapy in mice[J].J Control Release,2012,162(2): 349-354.

[12]Fan YJ,Huang NS,Xia L.Genistein synergizes with RNA interfer⁃ence inhibiting survivin for inducing DU-145 of prostate cancer cells to apoptosis[J]．Cancer Lett,2009,284(2):189-197．

[13]Kim HC,Al-Mahrouki A,Gorjizadeh A,et al.Effects of biophysical parameters in enhancing radiation responses of prostate tumors with ultrasound-stimulated microbubbles[J]. Ultrasound Med Biol, 2013,39（8）：1376-1387.

[14]Anderson CR,Hu X,Zhang H,et al.Ultrasound molecular imaging of tumor angiogenesis with an integrin targeted microbubble con⁃trast agent[J].Invest Radiol,2011,46(4):215-224.

[15]Negishi Y,Hamano N,Tsunoda Y,et al.AG73-modified Bubble li⁃posomes for targeted ultrasound imaging of tumor neovasculature[J]. Biomaterials,2013,34(2):501-507.

[16]Hwang JH,Zhou Y,Warren C,et al.Targeted venous occlusion us⁃ing pulsed high-intensity focused ultrasound[J].IEEE Trans Biomed Enq,2010,57(1):37-40.

[17]Jackson JK,Pirmoradi FN,Wan CP,et al.Increased accumulation of paclitaxel and doxorubicin in proliferating capillary cells and prostate cancer cells following ultrasound exposure[J].Ultrasonics, 2011,51(8):932-939.

[18]Bai WK,Wu ZH,Shen E,et al.The improvement of liposome-medi⁃ated transfection of pEGFP DNA into human prostate cancer cells by combining low-frequency and low-energy ultrasound with micro⁃bubbles[J].Oncol Rep,2012,27(2):475-480.

[19]Liu Y,Yi S,Zhang J,et al.Effect of microbubble-enhanced ultra⁃sound on prostate permeability:a potential therapeutic method for prostate disease[J].Urology,2013,81(4):921.