脊柱模式生物斑马鱼用于内耳科学领域研究的进展

周金章 综述 龙孝斌 审校

斑马鱼(danio rerio)属鲤科、辐鳍亚纲、短担尼鱼属，原产于印度等地水域。斑马鱼体型纤细，成鱼体长约3～5 cm,寿命2～3年；其胚胎及早期幼鱼通体透明，生殖周期短、繁殖能力强,且基因与人类基因约87%相似。鉴于斑马鱼以上生物学特性，耳科学研究者亦采用斑马鱼模型探讨毛细胞再生、遗传性聋机制、耳毒性和抗耳毒性药物筛查等。为此，本文对近年来斑马鱼模型用于内耳科学领域的研究现状及进展综述如下。

1 斑马鱼内耳与侧线系统解剖

斑马鱼虽无外耳和中耳，但具脊椎动物之典型内耳解剖结构。斑马鱼内耳由三个半规管(前、后和水平半规管)、耳石器官(椭圆囊、球囊和听壶)组成；半规管、椭圆囊主要行前庭平衡功能，而球囊及听壶则司听觉感知功能。除内耳外，斑马鱼还具有另一感觉神经器官—侧线系统，其由大量单个神经丘组成，每个神经丘中央包含一簇由神经支配的感觉毛细胞，其功能为探测自身局部水流及低频振动、调节诸如学习、逃避及扑食等行为[1]。由于侧线毛细胞与内耳毛细胞功能及分子结构极为相似且便于活体观察及干预，现已广泛用于毛细胞发育、再生、听觉及前庭功能障碍研究[2]。

2 斑马鱼毛细胞损伤与再生研究

2.1斑马鱼毛细胞损伤模型的建立 类似哺乳动物，斑马鱼对氨基糖苷类抗生素及顺铂等耳毒性药物有类似敏感性。Harris等[3]利用新霉素损伤斑马鱼幼鱼侧线毛细胞，通过5-溴脱氧尿嘧啶核苷(Brdu)标记显示，毛细胞损伤后48小时可观察到大量有标记的增殖细胞，此种利用耳毒性药物浸泡幼体斑马鱼损伤其毛细胞的方法简便有效，是目前研究斑马鱼毛细胞损伤的最常用方法；Schuck等[4]应用连续噪声刺激建立斑马鱼内耳毛细胞损伤模型并观察毛细胞改变；而Uribe等[5]则采用庆大霉素腹腔注射法建立成年斑马鱼内耳毛细胞损伤模型，亦取得满意效果。

2.2斑马鱼再生毛细胞的来源 已知哺乳动物耳蜗毛细胞缺乏再生能力，前庭感觉上皮细胞再生能力有限，而再生的毛细胞可能来源于前体干细胞[6]；相反，部分非哺乳脊柱动物如鸟类、两栖类及鱼类，其毛细胞损伤后具有较强的再生能力；研究表明，鸟类支持细胞是再生毛细胞的来源且存在两种再生方式，即直接分化(损伤早期)和分裂增殖[7]； Hernandez等[8]采用绿色荧光蛋白(GFP)标记的SqET4 和 SqET20转基因斑马鱼研究发现，其侧线毛细胞在损伤后也存在与鸟类相似的再生方式，且再生毛细胞大多来源于表达Sox2(sex determining region Y related high mobility group box-2,SKY related HMG box-2)的前体细胞；Mackenzie等[9]采用新霉素、顺铂和硫酸铜等作用于侧线毛细胞，并应用氟苯达唑抑制细胞增殖后提示，支持细胞增殖对毛细胞再生过程起主要作用；而Ma等[10]研究发现，损伤后再生的毛细胞主要由侧线神经丘中央群的支持细胞分裂而来。

2.3参与斑马鱼毛细胞再生的基因及信号通路 与小鼠模型相似，斑马鱼atoh1基因(人类Math1的同源基因)也是维持毛细胞分化和发育所必需的，过表达atoh1也可产生大量毛细胞[11]；既往哺乳动物模型研究认为Sox2可维持多能干细胞的潜能或涉及早期细胞分化，Millimaki等[12]通过斑马鱼模型研究发现，Sox2具有维持毛细胞生存及再生过程中支持细胞直接转化为毛细胞的功能；Lin等[13]研究发现，阻断视网膜母细胞瘤(retinoblastoma，RB)基因与Raf-1蛋白激酶的交互作用可阻断RB的磷酸化，进而阻碍斑马鱼侧线支持细胞增殖再生为毛细胞；Schuck等[14]则通过基因微阵列研究分析认为，斑马鱼内耳毛细胞在声损伤后生长激素的表达显著上调，而通过腹腔注射人工合成的生长激素可促进内耳毛细胞显著增殖。

近年研究认为，Notch信号通路存在于毛细胞再生过程中。在斑马鱼侧线系统，Notch信号通路成员(notch3,deltaA,atoh1a)在氨基糖苷类抗生素诱发毛细胞损伤后24小时内表达上调，此时支持细胞分裂活跃且新生毛细胞开始形成[10]；Liang等[15]利用数字化基因表达技术发现信号传导与转录激活因子3(signal transducer and activator transcription,stat3)/细胞因子信号传导抑制因子3(suppressor of cytokine signaling 3,socs 3)(stat3/socs3)通路可调节斑马鱼毛细胞再生过程，且和哺乳动物模型一样，该通路也存在严格负反馈调节；最新研究提示Wnt/beta-catenin信号通路也参与斑马鱼毛细胞再生调控，即活化Wnt信号可以促进神经丘内静止成熟的支持细胞重新进入增殖状态，而过表达dkk1b(Wnt信号抑制剂)则可抑制包括细胞分化和再生形式的增殖[16]。

3 斑马鱼在遗传性聋中的应用

3.1遗传性聋斑马鱼模型 据统计，我国新生儿极重度聋发病率约为1/1 000，其中50%以上与遗传因素有关[17]。2000年Ernest等[18]首先报道斑马鱼mariner突变体可出现内耳毛细胞束异常、内耳微音器电位减弱等，此形态及功能缺陷与编码异常肌球蛋白7a(myosin Ⅶa)小鼠shaker-1突变体极为类似；研究[19]发现，grhl2bT086突变系斑马鱼表现为听泡扩大、耳石变小及半规管畸形，但其毛细胞发育正常，而注射人工合成野生型斑马鱼grhl2b、人类grhl2或小鼠grhl2(grainyhead-like 2)mRNA则可拯救突变表型，表明grhl2bT086突变斑马鱼品系为研究人类DFNA28渐进性听力损失的理想动物模型。此外可用于遗传性聋的斑马鱼模型还包括eyal、colorless 、sputnik等。

3.2遗传性聋发生机制 经过近二十年努力，目前已鉴定出64个遗传性聋基因[20]，但部分新颖基因并不能解释听力损失的细胞或分子机制。Busch-Nentwich等[21]对斑马鱼同源基因DFNA5研究发现，该基因与尿苷二磷酸葡萄糖脱氢酶[uridinc 5’-diphos phate(UDP)-glucose dehyrogenase,Ugdh]的表达密切相关，而后者是细胞外基质透明质酸(hyaluronic acid,HA)形成的关键酶，故推测DFNA5的表达产物主要扮演细胞外基质的角色；转录因子sox10突变与Waardenburg 综合症相关，但其调控机制仍不明确，Dutton等[22]通过体内检测斑马鱼DNA片段联合比较基因组学的方法认为， Tcf/Lef、Sox及FoxD3等转录因子靶位点可促进sox10在神经嵴及内耳上皮表达；Riazuddin等[23]对耳聋家系研究发现CIB2突变可导致人类非综合型DFNB48遗传性聋，此基因可编码Ca2+及整合素结合蛋白，通过吗啉环修饰的寡核苷酸(morpholinos，MOs)抑制斑马鱼CIB2的表达，导致斑马鱼神经丘发育缺损、毛细胞微音器电位减弱；Yariz等[24]通过全外显子组测序发现，OTOGL基因可编码耳胶蛋白类似物，而MOs抑制OTOGL表达后，导致斑马鱼内耳解剖结构异常及感音性听力损失。

4 斑马鱼用于药物筛查研究

4.1耳毒性药物筛查 耳毒性药物主要导致听觉毛细胞损伤甚至消失，但因缺少简便有效的听觉评价模型，临床批准上市的药物多无耳毒性评估指标。2005年Ton等[25]首次应用斑马鱼模型评估药物耳毒性效应，并初步建立了斑马鱼药源耳毒性模型；随后Chiu等[26]利用斑马鱼药源模型筛查了FDA批准上市的1 040余种药物，结果提示21种为耳毒性化合物，包括斯伐他汀、坎地沙坦、长春胺等；2011年，Hirose等[27]对美国国家癌症研究所批准的88种抗肿瘤药物进行筛查，提示13种药物具有耳毒性，包括已知的药物如顺铂、氮芥等及可疑的药物如长春瑞滨、伊马替尼、阿霉素等。

4.2抗耳毒性药物筛查 既往文献显示，约50余种药物对毛细胞具有保护作用且大多数药物的保护作用并不完全。Owens等[28]采用新霉素建立斑马鱼药物性耳毒性模型，并对10 960种类药性小分子化合物进行筛查，提示PROTO-1、PROTO-2两种苯并噻吩甲酰胺类化合物能拮抗新霉素的耳毒性损伤；Ou[29]和Vlasits[30]等分别筛选了FDA批准的部分药物，发现他克林、它莫西芬和六氢芬宁等可拮抗部分氨基糖苷类抗生素的耳毒性损伤；Coffin等[31]采用侧线神经丘对61种已知的细胞死亡相关的分子靶点药理抑制剂进行筛查，结果提示自噬抑制剂(3-MA)、丝氨酸蛋白酶抑制剂(FUT-175)和蛋白酶体抑制剂(Z-LLF-CHO)均可有效拮抗新霉素、庆大霉素及顺铂的耳毒性。

5 斑马鱼用于行为学研究

因斑马鱼体型小、便于观察，通过其行为学特征可以简洁、有效地分析听觉、平衡感觉整合功能，如背光反应、前庭眼动反射等可有效评价斑马鱼前庭功能；听觉诱发惊恐反射存在与否可用来筛查听觉功能缺陷的个体[32]；而趋流性实验则可评价侧线毛细胞功能[33]；在听觉研究方面，Cervi等[34]首次利用行为学的方法描述了斑马鱼的听觉功能，实验采用食物奖赏与声觉刺激相结合的方法探讨斑马鱼听觉敏感声频范围，发现斑马鱼的行为听觉敏度与训练采用的声刺激频率高度相关。

目前，国内有关听觉及耳聋的斑马鱼模型研究尚处于起步阶段，成年斑马鱼内耳解剖、毛细胞分离和听觉诱发电位测量技术已经成熟，而随着斑马鱼基因组计划的进一步完善以及全球范围内更多斑马鱼研究实验室的建立，斑马鱼模型在内耳科学研究领域的应用也将更加广泛。

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