生物材料构建神经导管修复周围神经损伤的研究进展*

门永芝 综述 於子卫 审校

神经导管是由天然或人工合成材料制成的、用于桥接神经断端的组织工程支架材料,具有引导和促进神经再生作用。目前，外科手术治疗周围神经损伤效果不尽如人意，尽管自体神经移植是周围神经损伤(>5 mm)修复的金标准，但该方法仍存在一系列问题，如：供体来源受限、供体损伤及形态不匹配、供区神经瘤形成及运动、感觉障碍等。周围神经损伤的修复仍是临床一大难题，随着各种实验技术的发展及创新，各种生物材料构建神经导管用于修复外周神经损伤取得了可喜的成绩，临床应用生物材料构建神经导管作为自体神经移植的替代方案前景广阔。

制备神经导管的材料主要包括非生物降解材料、生物降解材料和生物衍生材料。理想的神经导管首先要满足神经细胞生长所需要的基本要求，即：①导管降解能够和神经恢复同步，且完全降解；②良好的组织相容性和无毒性；③具有光滑的内表面，避免影响再生神经的生长，并且易于细胞生长和黏附；④管壁具有选择通透性，能够从外周组织吸取营养物质；⑤良好的物理机械性能和柔韧性；⑥易于加工成型[1]。

直接的无张力外周神经修复不能实现时，神经导管就成为桥接感觉神经断端缺损(≤3 cm)的理想方法，而自体神经移植是修复长距离(>3 cm)混合性或运动神经损伤的金标准[2]。目前有五种通过FDA认证的神经导管，其中Neurotube(PGA)、Neurolac(PLCL)、NeuraGen(I型胶原)、NeuroMatrix Neuroflex(I型胶原)四种是生物可降解(降解率3个月至4年)的，而SaluBridge(PVA凝胶)[3]是不可降解吸收的。

1 生物聚合物

生物聚合物是生物相容的聚合物的来源，往往具备可调的机械性能和降解速度,这些特性与再生神经的生长相辅相成。此外，生物聚合物还具有贮藏和释放近端神经纤维生长所需的生长因子和细胞外基质蛋白的潜力，一些生物聚合物，如：角蛋白能循环的整合结合域(RGD基序)，在较短的小鼠神经缺损模型中取得了较好的修复效果[4]。

1.1Ⅰ型胶原 Ⅰ型胶原是细胞外基质的主要成分之一，有良好的生物相容性和理想的弹力强度，可以为细胞所识别，对细胞也有趋化性；不仅为细胞提供支持保护作用，而且与细胞的粘附、生长、表达均有密切关系，被广泛应用于周围神经缺损的修复[5]；但是胶原具有降解速度快、力学性能较差的缺点。

1.2壳聚糖 壳聚糖是一种天然多糖，是一种良好的神经修复材料，可以在体内降解为单糖，对神经细胞基本无毒害作用。Hsu等[6]提出相较在聚交酯上生长而言，雪旺细胞在壳聚糖上生长会上调NGF的基因表达水平；大量研究证实，壳聚糖对神经细胞有较好的吸附性并可以促进体外神经细胞的存活及轴突的再生，这表明以壳聚糖为材料的生物支架可以适用于外周神经的轴突再生[7,8]。

2 生物合成材料

生物合成材料是合成聚合物，与生物聚合物相比往往其生物相容性较差，但其降解速度可调、机械强度及孔隙率和微观结构可控等属性为其临床应用提供了可行性。

2.1聚乙醇酸 (PGA) PGA具有良好的生物相容性和生物降解性能, 但是作为聚酯类，就其物理及化学性质来看，其临床应用受到其降解率过快、低溶解度和快速释放酸性降解产物的限制[9]。

2.2聚己内酯(PCL) PCL具有优良的生物相容性和较慢的降解速率，不适合修复断端缺损>3 cm的神经损伤。相对PGA而言，PCL具有更大的柔韧性及疏水性[9]，且PCL成本低，可再生，易于消毒灭菌，其良好的柔韧性易于加工成型。有文献报道，使用PCL导管修复大鼠长达1 cm缺损的坐骨神经断端，其再生神经轴突生长良好，与自体神经移植相比无明显差异，有望临床推广[10]；Jin等[11]运用左旋聚己内酯(PLCL)修复大鼠1 cm缺损坐骨神经断端，实验结果证实，PLCL组大鼠的修复神经功能性运动恢复良好，腓肠肌肌僵直力量及肌肉重量分别达到了自体神经移植组的85%和82%，而神经传导和复合肌动作电位两组无明显统计学差异。

2.3乳酸-羟基乙酸共聚物[ poly ( lactideOcoOglycolide),PLGA ] PLGA一种应用非常广泛的生物可降解高分子材料,它具有较好的生物相容性,并且比较容易加工成型。近年来,随着组织工程学的兴起和迅速发展, PLGA成为组织工程支架的首选材料之一，PLGA是目前广泛应用于骨、软骨、血管、神经、皮肤等组织的生物可降解材料,显示出良好的临床应用前景。

PLGA具有良好的生物相容性、可降解性和可塑性等优点,并能灵活地控制材料的分子量、降解时间、孔隙率和孔径等,但细胞在支架材料上的生长、移植和内生长率则直接依赖于支架的多孔结构、孔隙率、孔的直径和孔的形状。何晨光等[12]使用PLGA为材料,采用静电纺丝方法制备纤维支架,体外细胞培养实验证明, PLGA纳米纤维支架能很好的支持细胞正常的黏附和增殖活动；李志跃等[13]运用聚乳酸聚羟基乙酸共聚物(PLGA，85∶15)三维神经导管，即外壁有微孔，内含微丝，微孔孔径为70～80 μm，孔隙率约为75%，应用这种三维导管修复SD大鼠周围神经的缺损，并在支架材料外涂以黏附蛋白，在管内注入神经营养因子，证实了这种三维立体神经导管具有适度的管壁通透性和孔隙率、降解速度适当及生物活性物质缓释性等特点，初步证明该导管能有效引导SD大鼠坐骨神经再生。

3 新型静电纺丝材料的体外试验研究

静电纺丝是一种简便易行的新型组织工程多孔支架制备方法,具有其他方法不具备的独特优势。由于静电纺丝纳米纤维支架材料与细胞外基质中的胶原纤维相似，高比表面积、高的孔隙率和可调节的力学性能及降解性能在组织工程中备受关注[14～16]。

3.12D随机排列静电纺丝纳米纤维神经导管 Lee等[17]应用静电纺丝技术制备PCL/Ⅰ型胶原聚合神经导管，运用端侧神经吻合术促进周围运动神经再生，研究相邻未受损伤的神经，基于神经导管生物材料同时保留未受损伤的神经功能，是否可作为支配失神经支配肌肉的神经来源，在急性大鼠胫腓骨神经损伤模型中得到了验证；但这种二维随机排列静电纺丝纳米纤维导管材料对于神经轴突的定向生长作用并没有进一步研究。

3.23D单向纵行排列静电纺丝PLGA材料 材料加工技术不断进步的同时，也促进了再生神经修复的试验研究，原有的二维材料为更贴近体内神经生长微环境的三维立体管状材料所取代。很多学者在此基础上，研究单向纵行排列的纳米纤维导管与随机排列的纳米纤维导管在引导雪旺细胞有序生长方面的作用，大量研究证实雪旺细胞轴突生长在单向排列的纳米纤维表面比随机排列的纳米纤维表面要快。这种纳米纤维材料是由聚交酯、聚己内酯、聚乙醇酸、琼脂糖及丝素蛋白构成[18～20]，单向纵行排列的纳米纤维材料成为近几年外周神经修复的首选材料，在该基础上三维立体排列的单向纵行纳米纤维材料用于体外雪旺细胞的培养有了实验基础，且有研究表明，在三维立体纵行单向排列的纳米纤维导管上体外培养的雪旺细胞轴突生长比在二维随机排列的纳米纤维导管上生长快[21,22]。Jin等[23]通过构建大鼠坐骨神经损伤模型，运用纵行排列的纳米纤维神经导管修复10 mm缺损神经断端，证实导管组与自体神经移植组差异无显著统计学意义，该发现为体内人工神经及导管材料复合物修复神经损伤奠定了基础。

欧阳等[24]使用单向对齐无缝3D静电纺丝胶原/PLGA神经导管修复大鼠13 mm缺损的坐骨神经断端，证实了这种导管对种子细胞及再生神经的引导作用仅次于自体神经移植。

4 利于神经再生微环境改善的神经导管

目前市面上的神经导管大多为生物相容性的、可降解的中空的管道，损伤神经的两个断端分别被缝合在导管两端，这些导管作为再生神经的一个中空、孤立的生长空间，在不做任何治疗的情况下，改善了神经的再生。但是对于长度超过1 cm的神经缺损，通常因为神经导管不能在一段时间提供轴突横贯神经缺损所需的结构性支持作用而导致再生失败。在一定时间内轴突不能连接到它们的靶组织，就会丧失神经的再生能力以及功能恢复的可能性[25]，对于人体而言，轴突以及雪旺细胞—外周神经系统的支持细胞再生能力的下降通常始于损伤之后的8周，在半年到一年内，再生更是不太可能的[26]。基于这些观点，研究认为，相比自体、异体神经移植而言，神经导管必须提供轴突再生的结构性支持[27]。为了促进神经再生的速度，神经导管除了应该提供对再生神经的物理支持和引导外，理想的神经导管还必须提供相关的生化反应信号来引导轴突的再生，以在周围神经再生过程中发挥积极作用[28]。近年来，很多学者对材料表面加以修饰并改进制造方法，使得神经导管为雪旺细胞等种子细胞创造出更有利于神经生长的微环境，更适应神经的再生。

沈华等[29]运用静电纺丝的PLGA/Chitosan导管内层涂布睫状神经因子(CNTF)，修复断端缺损为25 mm的犬胫骨神经，三个月后通过肌电图测试、S100免疫荧光染色、图像分析等得出，PLGA/Chitosan-CNTF导管组与自体神经移植组对于神经再生效果无明显差异。Rui等[30]已构建出可以缓释血管内皮生长因子(VEGF)长达4周的PLGA神经导管，为轴突的再生提供营养充足的生长环境，有望用于体内外周神经修复。

Neal等[28]通过构建Laminin/PCL混合纳米纤维神经导管证实这种Laminin纳米纤维，无论是在几何形状还是组成成分以及对神经元样细胞及神经前体细胞的吸附性、分化及神经突的伸展方面，可以很好地发挥模拟基底膜的功能；Neal运用这种导管材料修复大鼠长1 cm缺损的胫骨神经，通过热缩足反射潜伏期测试感觉功能的恢复、步法分析运动功能的恢复情况，发现Laminin/PCL组都比PCL组要好的多；Hsu等[31]运用Laminin修饰的多壁式神经导管与骨髓间充质干细胞共培养修复SD大鼠断端达1 cm缺损的坐骨神经，亦获得满意的效果。

Xiong等[32]通过雪旺细胞与神经干细胞共同培养于NT-3缓释的PLGA导管材料上，探寻中枢神经修复的实验基础，结果证实雪旺细胞可以促进神经干细胞向神经元分化，并可创造更利于神经生长的微环境；亦有很多学者致力于雪旺细胞与干细胞的共培养或是干细胞与导管材料的共培养，以寻找更利于神经再生的条件，以达到外周神经修复运动与感觉恢复的理想效果[33,34]。

5 生物材料在耳鼻咽喉头颈外科领域修复神经损伤的应用前景

喉返神经是比较特殊的外周神经，在耳鼻咽喉与头颈外科，喉返神经损伤比较常见，而对于较严重的喉返神经损伤，比如神经在手术或者外伤中被切断或挤压，再生轴突的生长可能不会达到预期神经对喉部肌肉的再支配效果；到达肌肉的再生神经可能可防止肌肉的失神经萎缩，但却不能引起随意支配；有些神经轴突不能到达靶器官，而有的却往错误的方向发展，导致拮抗肌同步收缩和运动。因此，外科医生们发现很难运用神经移植术恢复瘫痪喉肌的有效运动[35]。

自体神经移植术引发的种种问题如供体受限、创伤神经瘤的形成等，促进了组织工程学的发展，生物材料和种子细胞为喉返神经修复提供了科研思路。Birchall等[36]运用聚羟基丁酸酯(PHB)材料桥接膈神经和喉返神经断端，修复猪一侧喉返神经损伤模型，并将在喉入口处支配喉内收肌群的喉返神经分支切断，目的是选择性的实现环杓后肌的神经再支配，4个月后，喉部肌肉总重减轻，而环杓后肌重量增加，说明已经逐步达到神经肌肉的再支配。Paviot等[37]尝试分别将嗅粘膜来源和嗅球来源的嗅鞘细胞与基质胶(matrigel)混合，注射于大鼠迷走神经损伤附近区域，手术后三个月，通过视频喉镜、肌电图记录评估喉肌活动、“连带运动”现象和延迟，结果显示，嗅粘膜来源的嗅鞘细胞组通过改善肌电活动和神经传导极大地促进了组织愈合，但是却能诱发异常运动和不良功能恢复。相比而言，嗅球来源的嗅鞘细胞可以增加有髓神经纤维和神经传导的数量，并可通过诱导轴突定向再生改善神经功能的恢复。

面神经缺损在临床实践中亦非常普遍，损伤来源包括腮腺恶性病变的切除手术、外伤及颞骨岩部胆脂瘤手术等，其损伤可导致面部肌肉运动障碍,给患者带来很大的心理压力。面神经缺损修复一直是医学领域的一个热点及难题，面神经横断后,神经功能恢复的希望非常渺小，而神经修复手术给患者带来的经济负担也显著降低了患者的生活质量。随着显微外科技术的发展与进步，面神经修复水平有了显著的提高，但是同样存在供体受限、供区神经瘤形成等问题。神经组织工程技术通过三个关键因素(人工神经导管、神经营养因子、细胞培养)以期促进面神经再生而解决以上问题。近年来有关面神经损伤修复的方法，体外试验包括干细胞和/或生物导管材料，前者包括骨髓干细胞、脂肪干细胞、牙髓细胞以及神经干细胞，后者包括胶原、动静脉血管以及聚乙醇酸。众多实验结果表明，生物材料联合神经营养因子及种子细胞修复损伤神经效果显著，在电生理、神经电位传导等多项检测指标方面与自体神经移植组无明显差异[38,39]。

生物材料在外周神经尤其是坐骨神经损伤修复方面日臻完善，在耳鼻咽喉与头颈外科的神经损伤修复中也前景广阔。理想的神经桥接材料不仅要有引导种子细胞迁移和轴突定向朝着远端目标生长的功能，保证降解速率与神经恢复同步，并能够作为神经营养因子、神经生长因子的载体，起到缓释这些因子的作用，模拟神经在体内生长的微环境，提高神经纤维的再生能力。随着相关实验研究的不断深入，各种生物材料、神经生长内环境、种子细胞与干细胞在外周神经修复中的作用已日渐明了，周围神经损伤修复呈现出蓬勃的生机并将逐步应用于耳鼻咽喉头颈外科临床。

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