磨盘柿叶总黄酮的提取研究

孙彩云，柳凤娟

（1.河北联合大学轻工学院[1]，河北唐山063000；2.天津华堪矿业选冶技术开发有限公司，天津301900）

磨盘柿叶总黄酮的提取研究

孙彩云1，柳凤娟2

（1.河北联合大学轻工学院[1]，河北唐山063000；2.天津华堪矿业选冶技术开发有限公司，天津301900）

采用乙醇法和半仿生法提取磨盘柿叶总黄酮，乙醇法最佳提取工艺：70%乙醇为溶剂，固液比为1∶10，回流时间为1h，提取温度为70℃。半仿生法最佳提取工艺：提取温度80℃，时间1h，固液比为1∶20。

磨盘柿叶；黄酮；半仿生提取

柿叶是柿属植物柿的叶片，柿子在我国各地普遍栽培，大约有40多种，京津唐地区主要以磨盘柿闻名。柿果、柿蒂、柿花、柿叶、柿根皮均可入药。现代科学分析发现，柿叶除含有相当可观的蛋白质、氨基酸及多种维生素（Vc可达1800mg/100g，远高于常见的水果和蔬菜）外，还有胆碱、黄酮甙、芦丁和丹宁，具有抗菌、消炎、活血、降压、降脂、抗癌、去黄褐斑作用[1]，可广泛开发用于食品、药品和化妆品。我国柿叶资源丰富，从柿叶提取黄酮可变废为宝，提高其开发利用价值。常用的提取方法为乙醇浸提法。半仿生提取法[2，3]是模仿口服药物在胃肠道的转运过程，为经消化道的中药试剂设计的一种提取工艺。根据仿生学原理，人体胃、小肠、大肠的体液pH值分别为0.9～1.5、7.6、8.3～8.4。半仿生法采用不同pH值的酸性水和碱性水依次连续提取，其目的是尽可能地提取和保留原药中的有效成分。本文采用两种方法提取黄酮，优化提取工艺，为其开发利用提供参考。

1材料与方法

1.1 材料、试剂及仪器

1.1.1 原料磨盘柿叶（采集于河北遵化，干燥、粉碎，过40目筛备用）。

芦丁（BR，含量≥95%）、NaOH、HCl、无水乙醇、NH4·H2O、NH4Cl，以上均为分析纯；AB-8大孔树脂。

752紫外-可见分光光度计（杭州，1cm石英比色皿）；HH-8恒温数显水浴锅（江苏）；BS124S电子天平（北京）；DELTA320酸度计（成都）。

1.2 实验方法

1.2.1 乙醇提取法称取2g柿叶粉，加入一定量乙醇溶液，在水浴中进行回流提取，提取液定容至相同体积，采用分光光度法进行定量分析，分别考察乙醇浓度、固液比、温度、时间等对磨盘柿叶总黄酮提取的影响，并采用正交试验优化提取工艺。

1.2.2 半仿生提取法称取2g柿叶粉，依次加入pH值约为2.0的HCl溶液，pH值约为7.5和8.5的NH3NH4Cl缓冲溶液作为提取液，在一定的温度下回流提取一定时间，合并3次提取液，用70%乙醇定容至150mL，摇匀，准确吸取1.0mL稀释至50mL，以70%乙醇做参比，在λmax处测定其吸光度。选取提取温度，提取时间，料液比等3因素，进行正交实验设计，优选半仿生法提取工艺条件。

2结果与讨论

2.1 芦丁紫外吸收曲线和标准曲线

分别吸取50μg·mL-1的芦丁标准溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL于5支10mL比色管中，用70%乙醇稀释至刻度，摇匀。以试剂空白作参比，在近紫外区绘制吸收曲线和标准曲线。

磨盘柿叶黄酮提取液经AB-8大孔树脂纯化（大孔树脂的预处理及纯化方法参考文献[4]法），在近紫外区扫描吸收曲线。

图1 芦丁和磨盘柿叶黄酮紫外吸收曲线Fig.1Ultravillet asorption curve of rutin and mopanpersimmon leaves flavonoids

图2 芦丁标准曲线Fig.2Standard curve of rutin

芦丁和磨盘柿叶黄酮均在272nm有最大吸收，故选择272nm作为检测波长，标准曲线回归方程为：A=33.3C+0.0295，相关系数r=0.9998，芦丁浓度在0～0.025mg·mL-1范围内线性较好，可据此进行定量分析。

2.2 乙醇法提取磨盘柿叶总黄酮的工艺条件

2.2.1 乙醇浓度对磨盘柿叶黄酮提取率的影响称取2g柿叶粉于锥形瓶中，按固液比1∶10，分别加入不同浓度的乙醇溶液，于60℃水浴回流提取1h，滤液用70%乙醇定容至50mL。准确吸取1.0mL稀释至50mL，以溶剂为参比，在272nm处测定其吸光度，结果见图3。

图3 乙醇浓度对提取黄酮的影响Fig.3Effect of alcohol concentration to extract flavoniods

由图3可知，A值随着乙醇浓度增大而增大，当乙醇浓度为70%时，A值最大。在提取过程中观察到提取液中叶绿素的含量也随着乙醇浓度的增大而一直增大，80%乙醇提取液呈绿棕色，故选择最佳乙醇浓度为70%。

2.2.2 提取温度对吸光度的影响称取2g柿叶粉于锥形瓶中，按固液比1∶10，加入70%乙醇溶液，分别在不同温度水浴回流提取1h，滤液用70%乙醇定容至50mL，准确吸取1.0mL稀释至50mL，以溶剂为参比，在λmax272nm下测定其A值，结果见图4。

图4 温度对黄酮提取效果的影响Fig.4Effect of temperature to extract flavoniods

由图4可知，提取液A值随着提取温度的增大而增大，当提取温度为60℃时，A值最大，70℃后A值有所降低，较适宜提取温度范围为60～80℃。

2.2.3 提取时间对吸光度的影响准确称取2g柿子叶粉于锥形瓶中，按固液比1∶10，加入70%乙醇溶液，于60℃水浴中分别回流提取不同时间，滤液用70%乙醇定容至50mL。准确吸取1.0mL稀释至50mL，以溶剂为参比，在272nm处测定其吸光度，结果见图5。

图5 提取时间对黄酮提取效果的影响Fig.5Effect of alcohol concentration to extract flavoniods

由图5可知1.5～2h范围A值较大，1h时A值偏低不多，2.5h之后A值又降低，为节省能源选择提取时间为1h。

2.2.4 固液比对吸光度的影响称取2g柿叶粉于锥形瓶中，分别按不同固液比加入70%乙醇，于60℃水浴中回流时间1h，过滤，滤液用70%乙醇定容至50mL，准确吸取1.0mL稀释至50mL，以溶剂为参比，在272nm处测定其A值，结果见图6。

图6 固液比对提取液吸光度的影响料液比Fig.6Eeffect of solid-to-liquid ratio to extract flavoniods

由图6可见固液比1∶10以上时，A值较大，增长趋势变缓，为节省试剂，选择地固液比为1∶10。2.2.5正交实验结果根据以上单因素实验结果，乙醇回流提取法中影响柿叶总黄酮提取效果的因素有回流温度、回流时间、乙醇浓度、固液比，选用L9（34）正交表进行正交试验，结果见表1。

由表1可见最优组合为A3B1C2D2，即：70%乙醇，回流时间1h，提取温度70℃，固液比为1∶10。影响因素的主次顺序为回流温度＞回流时间＞乙醇浓度＞固液比。经验证在此条件下每百克柿叶粉可得黄酮1.18g。但70%乙醇提取液中叶绿素含量较高，溶液黄绿色，不利于黄酮的精制。

表1 乙醇提取法正交实验结果Tab.1Orthogonal experiment result of alcohol extraction

2.3 半仿生法正交实验结果

表2 半仿生法正交实验结果Tab.2Orthogonal experiment result of semi-bionic extraction

最优组合为A3B2C3，即：固液比为1∶20，提取温度80℃，时间1h。影响因素主次顺序为固液比＞回流时间＞温度。经验证在此条件下每百克柿叶粉可得黄酮1.62g，且半仿生法提取液中脂溶性杂质少，溶液棕黄色，叶绿素含量明显低于乙醇提取法，但水溶性杂质会高于乙醇提取法。

3结论

（1）通过单因素实验和正交实验，确定了乙醇提取法最佳提取工艺条件：乙醇浓度为70%，回流时间1h，提取温度70℃，固液比1∶10。影响因素的大小顺序为：回流温度＞回流时间＞乙醇浓度＞固液比。在此条件下总黄酮得率1.18g/100g柿叶粉。

（2）运用半仿生法对磨盘柿叶黄酮进行了提取，用pH值分别为2.0、7.5和8.5的水溶液为提取溶剂各提取一次，通过正交实验确定最佳提取工艺条件为：提取温度80℃，时间1h，固液比为1∶20。影响因素主次顺序为：固液比＞回流时间＞温度。在此条件下总黄酮得率1.62g/100g柿叶粉，高于乙醇提取法，且提取液中叶绿素含量低，有利于精制。

［1］苏东海,吴穹,何淑芳,等.柿叶中黄酮提取工艺的研究［J］.食品科学,2005,26（增刊）:39-42.

［2］陈丛瑾,黄克瀛,李德良.正交试验法优选香椿叶总黄酮的半仿生提取工艺［J］.食品科技,2007，（6）:119-121.

［3］庞中磊,唐文.柚皮总黄酮半仿生提取工艺研究［J］.上海应用技术学院学报（自然科学版）,2012,12（1）:6-9.

［4］贝伟剑,彭文烈,罗杰.柿叶黄酮的大孔吸附树脂分离提纯富集［J］.中成药,2005,27（3）:257-261.

Extraction of total flavonoids from Mopan persimmon leaves

SUN Cai-yun1，LIU Feng-juan2
（1.Qinggong College,Heibei United University,Tangshan 063000,China；2.Tianjin North China Mining Mineral Smelting and Technology Development Company,Tianjin 301900,China）

The total flavonoids from Mopan persimmon leaves was separately extracted by alcohol extraction method and semi-bionic extraction method.The optimum extraction conditions of alcohol extraction:70%alcohol as solvent,solid-liquid ratio of 1∶10,refluxing time 1h,extraction temperature 70℃.The optimum extraction conditions of semi-bionic extraction:extraction temperature 80℃,time 1h,solid-liquid ratio of 1∶20.

Mopan persimmon leaves；flavonoids；semi-bionic extraction

R284.2

A

1002-1124（2014）02-0067-04

2013-11-20

孙彩云（1972-），女，河北遵化人，硕士，讲师，主要从事天然物提取及检测研究。