瘦素-下丘脑神经肽Y轴在2型糖尿病大鼠发病过程中的变化

杨新玲，李 杰，卢素玉，王海芳，郝慧瑶，张松筠

瘦素是一种脂肪细胞分泌的能量平衡调节激素，可抑制食欲、增加能量消耗、减轻体质量[1]。下丘脑神经肽Y(neuropeptide Y,NPY)是一种很强的食欲刺激因子，主要来自下丘脑弓状核，在摄食行为和能量消耗的整合中起重要作用[2]。NPY神经元是瘦素在中枢的作用位点，瘦素可与NPY神经元上瘦素受体结合，抑制NPY合成与分泌[3]，二者形成瘦素-下丘脑NPY轴，调节机体能量代谢。

大量研究表明瘦素与肥胖、2型糖尿病密切相关[4-6]。笔者先前的研究也已经证实，在2型糖尿病(正常→胰岛素抵抗→2型糖尿病)发病过程中大鼠血清瘦素水平呈递增趋势[7]。但NPY与2型糖尿病关系的研究还很少，且主要局限于肥胖及2型糖尿病患者[8-9]，2型糖尿病发生过程中NPY的变化及其与瘦素之间的关系国内外均未见报道。本研究通过观察在2型糖尿病大鼠模型形成过程中，瘦素、下丘脑NPY水平的变化，探讨瘦素-下丘脑NPY轴在2型糖尿病大鼠发病过程中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料来源 选用清洁级180～220 g雄性SD大鼠110只，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供。

1.2 2型糖尿病大鼠模型的建立 本研究通过改良的高脂饮食加小剂量(15 mg/kg)链脲佐菌素(streptozotocin，STZ)法建立2型糖尿病大鼠模型[10]。采用随机数字表法抽取20只作为正常对照组，喂以基础饲料；90只喂以高脂饲料(在基础饲料的基础上加10%猪油和2%胆固醇)，4周时将体质量超过正常对照组最高体质量的大鼠(60只)纳入高脂饮食诱导肥胖(diet-induced obese，DIO)组，余者淘汰，该时间点设为DIO4W，采用随机数字表法选取20只为DIO4W组；其余40只继续喂以高脂饲料4周(此时间点设为DIO8W)，采用随机数字表法选取20只为DIO8W组；剩余大鼠腹腔注射小剂量STZ，10 d后测空腹血糖大于正常对照组大鼠均值加3个标准差 (本研究确定该值为7.8 mmol/L)，且空腹血糖>7.8 mmol/L能维持3周者纳入2型糖尿病组(20只)。

1.3 空腹血清瘦素水平和下丘脑NPY水平测定 采用放射免疫法检测空腹血清瘦素和下丘脑NPY水平，实验大鼠禁食8 h，10%水合氯醛(3 ml/kg)腹腔麻醉后，心脏穿刺采血2 ml，4 ℃离心，取血清，检测瘦素水平；经心脏以0.9%氯化钠溶液灌洗全脑，断头取脑，以0.2 mol/L醋酸溶液煮沸10 min以灭活酶，取下丘脑，加入上述醋酸溶液1 ml匀浆，离心，取上清液，检测NPY水平。操作过程严格按照试剂盒(北京原子高科核技术应用股份有限公司)说明书进行，质控标准为批内变异系数<10%，批间变异系数<15%。

1.4 下丘脑NPY mRNA表达水平测定 采用实时荧光定量PCR(RT-PCR)法检测下丘脑NPY mRNA的表达。取下丘脑组织100 mg，迅速将组织置于4 ℃焦碳酸二乙酯(DEPC)水中洗去血液后，置冻存管保存于-80 ℃低温冰箱中。用Trizol(美国 Invitrogen 公司)提取海马组织总RNA后，用1.5%含EB的琼脂糖凝胶鉴定RNA质量，用核酸蛋白测定其水平及纯度。引物(美国 Invitrogen 公司)序列为：上游： 5′-GCTAGGTAACAAACGAATGGGG-3′； 下游： 5′-CACATGGAAGGGTCTTCAAGC-3′。PCR扩增条件：94 ℃预热5 min，94 ℃ 45 s、55.5 ℃ 35 s、72 ℃ 45 s(共35个循环)，72 ℃延伸5 min。取10 μl PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，以DNA Marker作为标准片段标记，以GAPDH电泳条带作为参照，结果用RT-PCR扩增靶基因产物的表达水平与GAPDH表达水平积分吸光度的比值表示。

2 结果

2.1 4组空腹血清瘦素水平和下丘脑NPY水平比较 4组空腹血清瘦素水平和下丘脑NPY水平比较，差异均有统计学意义(P<0.05)。DIO4W组、DIO8W组、2型糖尿病组空腹血清瘦素水平和下丘脑NPY水平均高于正常对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；DIO8W组、2型糖尿病组空腹血清瘦素和下丘脑NPY水平均高于DIO4W组，差异有统计学意义(P<0.05)；2型糖尿病组空腹血清瘦素和下丘脑NPY水平高于DIO8W组，差异有统计学意义(P<0.05，见表1)。

Table1 Comparison of fasting serum leptin and hypothalamic NPY levels in the four groups

组别例数血清瘦素水平(μg/L)下丘脑NPY水平(ng/L)正常对照组200 25±0 04133 5±16 9DIO4W组200 32±0 04∗164 9±20 6∗DIO8W组200 40±0 03∗○199 4±36 9∗○2型糖尿病组200 48±0 06∗○△255 1±40 8∗○△F值87 025270 782P值<0 001<0 001

注：与正常对照组比较，*P<0.05；与DIO4W组比较，○P<0.05；与DIO8W组比较，△P<0.05

2.2 4组下丘脑NPY mRNA表达水平比较 正常对照组、DIO4W组、DIO8W组、2型糖尿病组的NPY mRNA表达水平分别为(0.85±0.14)、(1.16±0.15)、(1.53±0.14)、(1.79±0.13)，差异有统计学意义(F=173.320，P<0.05)。DIO4W组、DIO8W组、2型糖尿病组的NPY mRNA表达水平均高于正常对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；DIO8W组、2型糖尿病组的NPY mRNA表达水平均高于DIO4W组，差异有统计学意义(P<0.05)；2型糖尿病组的NPY mRNA表达水平高于DIO8W组，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.3 相关性分析 4组大鼠空腹血清瘦素水平与下丘脑NPY水平、NPY mRNA表达水平均呈正相关(r=0.951、0.953，P<0.05)。

3 讨论

2型糖尿病作为一种代谢性疾病已成为人类健康的第三大杀手，预防和治疗糖尿病迫在眉睫[11]。瘦素是脂肪细胞分泌的一种调节能量平衡的重要激素，与2型糖尿病发病密切相关[12]。瘦素通过与其受体结合从而发挥中枢性和外周性生物学效应，在中枢瘦素主要通过下丘脑NPY这个中介物发挥作用[13-14]。NPY是由下丘脑弓状核神经元分泌和产生的，通过刺激进食、抑制产热和提高胰岛素水平来达到能量平衡[15]。大量动物研究表明，下丘脑的NPY神经元上含有瘦素受体，脑室注射瘦素可显著降低下丘脑NPY mRNA的表达；血清中瘦素水平减少,能使下丘脑NPY分泌增加，使大鼠出现多食、肥胖和血糖增高[16]。故现在认为瘦素与下丘脑NPY构成了瘦素-下丘脑NPY轴，参与摄食，影响糖脂代谢。目前对瘦素-下丘脑NPY轴的研究主要局限于肥胖及2型糖尿病患者，而本研究观察了2型糖尿病发生过程中NPY的变化及其与瘦素之间的关系。

本研究显示，在2型糖尿病大鼠模型形成过程中， DIO4W组、DIO8W组、2型糖尿病组空腹血清瘦素水平高于正常对照组，DIO8W组、2型糖尿病组空腹血清瘦素水平高于DIO4W组， 2型糖尿病组空腹血清瘦素水平高于DIO8W组，提示随着动物体质量的逐渐增加，空腹血清瘦素水平逐渐升高，机体对瘦素的反应减弱或无反应，即发生了瘦素抵抗，与张松筠等[10]的研究一致。本研究还发现，DIO4W组、DIO8W组、2型糖尿病组的下丘脑NPY水平和NPY mRNA表达水平均高于正常对照组，DIO8W组、2型糖尿病组的下丘脑NPY水平和NPY mRNA表达水平均高于DIO4W组， 2型糖尿病组的下丘脑NPY水平和NPY mRNA表达水平高于DIO8W组，提示在2型糖尿病大鼠模型形成过程中，下丘脑NPY 水平及NPY mRNA表达均逐渐增强，且与血清瘦素水平呈正相关。其可能机制与瘦素抵抗有关：瘦素的下游信号(如瘦素受体)出现结构及功能障碍[10]，使其不能正常发挥生理作用，包括对NPY神经元的抑制，于是导致下丘脑NPY 水平上调。NPY是强效的食欲刺激因子，其表达上调可引起大鼠摄食与体质量的明显增加。

总之，随着2型糖尿病大鼠模型的形成，下丘脑NPY水平及血清瘦素水平显著升高，提示瘦素-下丘脑NPY轴功能异常，出现瘦素抵抗。瘦素抵抗对NPY神经元的抑制减弱，使NPY表达水平升高，食欲增加，进一步促进肥胖，加重胰岛素抵抗，导致2型糖尿病的形成。但本研究只观察了上述一种现象，对其具体分子通路方面，还有待进一步研究。虽然还不清楚瘦素-下丘脑NPY轴是否为2型糖尿病的致病因素，但对其在2型糖尿病形成中的变化的研究将有助于对糖尿病发病机制的进一步认识，并为糖尿病的诊断及治疗开辟新的途径。

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