不同香烟烟雾暴露时间对大鼠肺组织树突细胞数量的影响研究

曹 磊，平 芬，马 铮，李 萍

烟草危害是人类健康最大的可以预防的危险因素，2012年我国原卫生部发布的《中国吸烟危害健康报告》[1]显示，我国吸烟人群超过3亿，约7.4亿不吸烟人群遭受二手烟的危害，吸烟可以导致呼吸、心血管、消化、内分泌等多系统疾病，每年约有100万人死于吸烟相关性疾病。吸烟致癌的机制被广泛研究，但是其对免疫系统影响的研究却较少。所以关于吸烟相关性疾病，不再仅强调其与癌症、心血管疾病的关系，还应注意其对机体造成的免疫损伤以及免疫损伤后的反复感染。

树突细胞(dendritic cells，DCs)是一种专职抗原提呈细胞(antigen-presenting cell，APC)，体内含量少，提呈作用超强，DCs能激活初始T细胞诱导机体的有效免疫应答，并决定免疫应答的方向，同时DCs在维持免疫耐受方面也具有重要作用[2]。其能提呈抗原，表达共刺激分子，分泌细胞因子，激活T、B淋巴细胞，产生免疫应答，是启动获得性免疫反应的关键因素[3]。本研究旨在观察不同香烟烟雾暴露时间对大鼠DCs数量的影响，为吸烟相关性疾病的临床治疗及药物研究提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 动物及分组 将清洁级雄性Wistar大鼠(购买于河北医科大学实验动物中心)50只，体质量(150±20)g，按照完全随机化法分为空白对照组(A组，10只)和香烟烟雾暴露组(40只)，按照不同暴露时间将香烟烟雾暴露组又分为香烟烟雾暴露4周组(B组)、香烟烟雾暴露8周组(C组)、香烟烟雾暴露12周组(D组)和香烟烟雾暴露8周戒烟8周组(E组)，每组10只。

1.2 研究方法 将香烟烟雾暴露组大鼠放在自制有机玻璃熏烟箱内(60 cm×60 cm×90 cm)，每天熏烟2次(间隔时间>6 h)，每次点燃5支香烟(钻石牌香烟，焦油量11.0 mg，烟气烟碱量1.0 mg，烟气一氧化碳量11.0 mg)放入有机玻璃熏烟箱内，燃烧15 min，休息5 min后再放入5支，每天点燃30支，持续2 h，香烟烟雾暴露间隔期间将大鼠置于正常无烟环境中饲养，任其自由采食、饮水。A组大鼠不熏烟，置于正常无烟环境中饲养。

1.3 取材 香烟烟雾暴露组大鼠分别在香烟烟雾暴露4周、8周、12周及香烟烟雾暴露8周戒烟8周后腹腔注射3%戊巴比妥钠50 mg/kg麻醉，腹主动脉放血处死，分离肺组织，取右肺中叶置于4%多聚甲醛固定液中保存24 h，常规石蜡包埋切片备用。A组大鼠16周后做相同处理。

1.4 DCs计数 以CD11c和S100蛋白作为大鼠支气管肺组织DCs的标志物，采用免疫组化法染色切片，以胞质染成棕黄色或黄色为阳性细胞。每张切片随机取10个高倍野(400倍)，使用IPP6软件计数染色阳性细胞数，取其平均值即为该张切片的阳性细胞数，也即DCs数量。

2 结果

CD11c、S100蛋白阳性DCs均在支气管管壁、炎症区域、血管周围分布明显。5组CD11c、S100蛋白阳性DCs数量比较，差异有统计学意义(P<0.05)。B、C、D、E组CD11c、S100蛋白阳性DCs数量均高于A组，C、D组均高于B组，D组高于C组，E组低于C组，差异有统计学意义(P<0.05，见表 1，图1～2)。

Table1 Comparison of the number of CD11c+and S100+DCs among five groups

组别例数CD11c阳性DCsS100阳性DCsA组108 6±0 98 4±0 8B组1010 1±0 8★10 3±1 1★C组1013 5±1 0★●12 9±1 6★●D组1014 6±1 1★●■14 2±1 7★●■E组1012 0±1 4★■11 6±1 4★■F值53 1427 41P值<0 001<0 001

注：与A组比较，★P<0.05；与B组比较，●P<0.05；与C组比较，■P<0.05；DCs=树突细胞

图1 5组大鼠肺内CD11c阳性DCs分布(免疫组化法，×400)

图2 5组大鼠肺内S100蛋白阳性DCs分布(免疫组化法，×400)

3 讨论

吸烟可以导致呼吸、心血管、消化、内分泌等多系统疾病，肺部有巨大的表面积、丰富的血流，如与香烟烟雾直接接触，会成为首当其冲的受害器官[4]。香烟烟雾暴露使肺组织局部巨噬细胞凋亡[5]，中性粒细胞激活、聚集，炎性递质释放[6]，肺毛细血管壁通透性升高，从而导致出血及间质性肺水肿。肺部DCs在维持肺脏免疫平衡中起着非常重要的作用。肺部DCs存在于人和鼠整个肺组织，包括气管、支气管、肺泡和脏层胸膜，在整个气管树内皮构成一个完整的DCs网络[7]。支气管肺组织中的DCs是呼吸系统免疫环境中最重要的抗原提呈和免疫调节细胞，发挥免疫前哨监视和诱导特异性免疫应答反应的功能。有研究表明，急性肺损伤早期即存在肺部DCs数量和成熟程度的增加，并可能通过增强Th1型免疫应答及促炎性细胞因子的分泌启动及加剧急性肺损伤早期肺部炎性反应[8]，且急性肺损伤时小鼠外周血DCs数量早期减少，随后逐渐增多，功能呈渐成熟状态[9]。尼古丁是香烟烟雾中具有免疫调节作用的物质，其多种功能是通过除中枢神经系统神经元以外的细胞上的尼古丁乙酰胆碱受体(nicotinic acetylcholine receptors,nAChR)来实现的。全身很多细胞均存在nAChR，如上皮细胞、淋巴细胞、肺泡巨噬细胞和嗜酸粒细胞[10]。在与烟草相关疾病的研究中，Ginzkey等[11]的研究发现nAChR、DNA损伤中的氧化应激反应与烟草相关癌症具有相关性，而在尼古丁与DCs的众多研究中均发现其可以改变DCs的生物活性[12]。李毅等[13]在大鼠哮喘模型研究中发现，尼古丁抑制DCs髓样分化因子88(MyD88)以及白介素(IL)-10、IL-12的表达，降低DCs刺激淋巴细胞增殖的能力，从而削弱了DCs的抗原识别和提呈功能。

本研究以CD11c和S100蛋白作为大鼠支气管肺组织DCs的标志物来研究不同香烟烟雾暴露时间对其肺脏DCs数量的影响。CD11c是分子量为150 kD的αX亚单位β2整合素家族成员，是确定DCs的特异性表面标志物之一，在大鼠髓系和淋巴系DCs，包括DCs前体、未成熟及成熟的DCs中均有较高的表达[14-15]。S100蛋白是一种氨基酸序列高度保守的、EF手型(螺旋2环2螺旋)的钙结合蛋白，通过对钙离子(Ca2+)的调节及与靶蛋白的相互作用，在体内发挥多种生物学作用。S100蛋白以Ca2+依赖的方式调控细胞内外的生理活动，部分S100蛋白被分泌到细胞外作用于白细胞，调控靶细胞的增殖，调节巨噬细胞和炎性细胞的活性。文献报道S100蛋白可以标记所有成熟及未成熟的DCs[16]。本研究观察到在炎性细胞浸润明显的支气管、肺组织区域DCs分布增多，炎症区域血管周围可见大量的DCs分布，这可能与DCs从血液中迁徙而来有关，与Lommatzsch等[17]的研究结果一致。本研究结果显示，随着香烟烟雾暴露时间的延长，CD11c和S100蛋白标记阳性DCs数量增多，D组>C组>B组>A组，而E组CD11c和S100蛋白标记阳性DCs数量少于C组，但多于A组，进一步说明香烟烟雾暴露能够诱导大鼠肺组织DCs数量增多，而且与暴露时间有关，戒烟后DCs数量减少。正常情况下肺部DCs数量十分稀少，不到肺实质细胞总数的1%。肺部DCs以未成熟的状态广泛分布于呼吸道上皮组织和黏膜下层中，气道DCs的这种分布有利于其及时获取和处理吸入抗原信息、维持气道上皮屏障功能完整。当外源性抗原进入机体后，DCs通过巨胞饮、吞噬、受体介导的内吞作用摄取外源性抗原，抗原经过DCs处理后，形成抗原肽片段，可经主要组织相容性复合体(MHC)分子及CD1分子途径得到有效的递呈。气道DCs在与吸烟相关性肺疾病中起着非常重要的作用。

本研究立足于香烟烟雾暴露对DCs数量的影响，并未就增多的DCs的来源做进一步研究，亦未对增多的DCs功能的改变做进一步了解，故将会在以后的研究中逐步深入。

总之，本研究结果表明香烟烟雾暴露可以导致大鼠肺组织DCs数量增加，且随着香烟烟雾暴露时间的延长，DCs数量增多越明显，戒烟后其数量有所减少。

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