中国汉族人群晚期糖化终产物受体基因-429T/C多态性对其mRNA和蛋白表达的影响研究

蔡 伟，徐积兄，张 微，朱伟锋，朱凌燕，刘 盈，肖钧仁，刘建英

许多研究表明，晚期糖化终产物受体(RAGE)对糖尿病慢性并发症起着重要作用[1-3]。RAGE是一个多配体的细胞表面分子，属于免疫球蛋白超家族。RAGE广泛分布于血管内皮细胞、单核巨噬细胞、肾小球系膜细胞、神经胶质细胞等。而且，RAGE表达水平受高血糖等环境的影响，尤其是长期高血糖所致大量晚期糖化终产物(AGEs)存在的条件下，RAGE呈高水平表达[1]。RAGE通过与其配体AGEs等相互作用，参与了糖尿病血管病变的发生与发展过程[2-3]。本研究的前期研究及其他研究均发现，RAGE基因-429T/C多态性与中国汉族人糖尿病血管并发症包括缺血性心脏病和肾病相关[4-5]。因而推测-429T/C多态性可能通过改变RAGE基因表达，从而影响RAGE在糖尿病血管并发症中的作用。因此，本研究拟通过检测不同基因型的糖耐量正常人外周血单核细胞(PBMC)RAGE的mRNA和蛋白表达水平，以初步了解RAGE基因-429T/C多态性对基因表达功能的影响。

1 资料与方法

1.1 临床资料 2012年8—12月在江西南昌地区糖尿病流行病学调查人群中，选取70名糖耐量正常的汉族人群作为研究对象，均经口服葡萄糖耐量试验(OGTT)筛查为糖耐量正常，排除糖尿病病史、高血压病史、脂质代谢紊乱史，无糖尿病家族史，而且血压、血脂和肝肾功能均正常。最终匹配选取TT基因型组11名和TC基因型组11名。两组性别、年龄、体质指数、血压、空腹血糖、餐后2 h血糖、糖化血红蛋白(HbA1c)水平比较，差异均无统计学意义(P>0.05，见表1)。本研究通过了南昌大学第一附属医院医学研究伦理委员会审查批准，并取得了受试者的知情同意。

1.2 材料 DNA提取试剂盒购自北京百泰克生物技术有限公司，人单核细胞分离液购自TBD公司，总RNA提取试剂盒购自Transgen公司，兔抗人RAGE抗体和羊抗兔-HRP购自Santa Cruz公司，随机引物和反转录酶购自美国Promega公司。

1.3 试验方法

1.3.1 PBMC提取与分离 抽取早晨空腹外周静脉血2 ml，按1∶1体积加入Hank′s液混匀后，小心缓慢地在其液面上加入2 ml细胞分离液，以2 000 r/min(离心半径145 mm)离心15 min，收集液界面上的细胞，放入含Hank′s液5 ml的试管中充分混匀后，以2 000 r/min(离心半径145 mm)离心10 min，吸去上清液，沉淀经反复洗2次后，收集细胞备用。

1.3.2 基因型检测 使用DNA提取试剂盒提取样本基因组DNA，然后进行目的基因片段的PCR扩增。PCR产物总长为344 bp，上游引物：5′-GGGGGCAGTTCTCTCCTC-3′，下游引物：5′-TCAGAGCCCCCGATCCTATTT-3′。PCR反应条件[5]：先预变性94 ℃ 10 min，继之变性94 ℃ 30 s，退火62 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 30 s，接着每个循环的退火温度依次下调0.5 ℃，共12个循环；其后变性94 ℃ 30 s，退火56 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 30 s，共30个循环；最后延伸72 ℃ 15 min。PCR扩增产物送生工生物工程(上海)股份有限公司进行直接测序，以确定RAGE基因-429T/C多态性的基因型。

1.3.3 实时荧光定量PCR检测RAGE mRNA表达水平 提取各组总RNA(按照试剂盒说明书操作)，核酸蛋白分析仪检测含量。以随机引物法合成cDNA，以cDNA为模板采用Taqman探针法进行实时荧光定量PCR。RAGE引物序列上游引物：5′-GGGCTCTTCACACTGGC-3′，下游引物：5′-CTCCAGTACTACTCTCTGCCTGC-3′；Taqman探针序列为：5′-CGACAAGCACGCTTAGTTGACGGC 3′( 5′标记为FAM，3′标记为TAMRA)。GAPDH引物序列上游引物：5′-CAGTCAGCCGCATCTTCCTTT-3′,下游引物：5′-GTGACCACGGGCCAATAC-3′；Taqman探针序列为：5′-CGTCGCCAGCGGAGCCACA-3′(5′标记为FAM，3′标记为TAMRA)。采用Applied Biosystems公司7300 实时荧光定量PCR检测系统进行扩增反应并读取试验数据。PCR反应条件：预变性95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，共40个循环。利用RAGE mRNA/GAPDH mRNA评定各标本RAGE mRNA表达水平。

1.3.4 Western blotting法检测RAGE蛋白表达 每个样本PBMC加入细胞裂解液100 μl，在4 ℃温度下裂解30 min，离心后取上清液进行蛋白含量的测定。配制8%分离胶与5%浓缩胶，上述每组蛋白取约30 μg加入等体积蛋白上样缓冲液，100 ℃煮沸5 min，进行聚丙烯酰胺电泳，随后转移到硝酸纤维膜上，与特异性第一抗体(1∶200稀释)、第二抗体(1∶1 000稀释)结合，最后利用Luminol Reagent发光显色。以GAPDH作为内参照，结果以RAGE与GADPH光密度比值表示。

表1 两组研究对象一般资料比较

注：HbA1c=糖化血红蛋白；*为χ2值

2 结果

2.1 个体样本-429T/C多态性基因型检测结果 对70名糖耐量正常的健康人进行了DNA提取与PCR扩增，对PCR扩增产物进行测序，获得了个体的RAGE基因-429T/C多态性的基因型，包括TT基因型57名和TC基因型13名(见图1)。

图1 RAGE基因-429T/C多态性基因型测序图

Figure1 The genotype sequencing graph of RAGE gene -429T/C polymorphism

2.2 两组RAGE mRNA表达水平 随机数字表法选取TC基因型组11名，采用性别、年龄、体质指数、血压、空腹血糖、餐后2 h血糖、HbA1c相匹配的原则选择TT基因型组11名。实时荧光定量PCR检测结果显示，TT基因型组RAGE mRNA表达水平(1.047±0.233)高于TC基因型组(0.740±0.209)，差异有统计学意义(t=2.42,P<0.05，见图2)。

2.3 两组RAGE蛋白表达水平 Western blotting检测结果显示，TT基因型组RAGE蛋白表达水平(1.121±0.252)高于TC基因型组(0.916±0.249)，差异有统计学意义(t=2.11,P<0.05,见图3)。

3 讨论

注：RAGE=晚期糖化终产物受体

图2 两组RAGE mRNA表达水平比较

Figure2 Comparison of RAGE mRNA expression levels between the two groups

图3 两组RAGE蛋白表达水平比较

在长期高血糖状态下，糖尿病患者体内大量的RAGE配体AGEs形成和堆积[6]。AGEs通过结合并激活RAGE，继而激发一些关键细胞信号传递途径如MAP激酶(包括p38和p44/42 MAPK)和核因子кB(NF-кB)等，诱导氧化应激及炎性反应，促使糖尿病患者出现血管病变如动脉粥样硬化、肾脏病变、视网膜病变等[3,7-8]。通过使用RAGE阻断剂以及RAGE基因敲除，可明显减缓或阻止糖尿病血管病变的发生与发展[9-10]。而且有证据提示，RAGE 与AGEs的相互作用也是导致糖尿病“代谢不良记忆效应”的重要原因之一[11-12]。由此可见，RAGE在糖尿病血管并发症的发病过程中担当重要角色。

本研究的前期研究发现，RAGE基因-429T/C多态性与中国汉族人糖尿病肾病相关，而且携带-429C等位基因者糖尿病肾病的发生风险更低[5]。这与香港Poon等[4]的研究结果相似，其研究表明携带-429C等位基因的中国人糖尿病肾病患者缺血性心脏病发生的风险更低。本研究检测了-429T/C多态性不同基因型(TT基因型和TC基因型)的糖耐量正常人PBMC的RAGE表达情况，研究结果发现携带TT基因型者RAGE mRNA和蛋白表达水平高于携带TC基因型者，从而提示-429C等位基因可能降低RAGE基因表达活性，进一步支持-429C等位基因与糖尿病血管并发症风险降低相关。然而，也曾有研究提示，携带-429C等位基因的白种人糖尿病视网膜病变发生风险更高，体外研究发现-429C等位基因和-374A等位基因明显增强RAGE基因转录活性[13]。虽然造成以上结果的原因目前仍不明确，但目前认为可能原因：RAGE基因存在着明显的种族差异性，不同的种族人群研究可能得出不同的结果，例如有研究包括笔者前期研究发现，中国汉族人RAGE基因-429T/C、 -374T/A和Gly82Ser多态性与白种人之间存在着明显的种族差异性[14-15]；基因转录及蛋白的表达是一个复杂的过程，其中影响因素较多，而且体外和体内条件存在较大不同，因而得出的研究结果也可能不一致；RAGE在不同的环境下或在不同的组织细胞中所起的作用也存在差异。

总之，本研究结果提示，RAGE的遗传变异性与RAGE基因表达相关，-429T/C多态性可能降低RAGE mRNA和蛋白表达水平，从而支持其与糖尿病血管并发症的风险降低相关。由于本研究采用PBMC作为研究对象，而PBMC并不能完全模拟其他细胞包括血管内皮细胞的病理生理状况，因而所得出的研究结果存在一定局限性。因此，今后将进行对血管内皮细胞和肾小球系膜细胞等不同细胞的研究，以进一步探讨RAGE多态性的作用。

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