环氧化酶2基因多态性与中国汉族人群缺血性脑卒中及其亚型的关系研究

陈忠云，李珊珊，李 婧，徐志伟，杨 旭

脑卒中已成为我国居民死亡的首要原因[1]，其中约80%是缺血性脑卒中(ischemic stroke，IS)[2]。新近研究表明，炎性反应在IS的发病机制中发挥重要作用，编码炎性分子的基因变异可能影响IS的发生、发展过程[3-4]。环氧化酶(cyclooxygenase，COX)作为催化花生四烯酸合成各种内源性前列腺素(prostaglandins，PGs)的限速酶，通过其代谢产物前列腺素E2(PGE2)来调节炎性反应[5]。COX在人体内主要存在COX-1和COX-2两种亚型。COX-2为诱导型，只在炎症及细胞因子等刺激因素诱导下生成。已有研究表明COX-2基因多态性与IS密切相关[6-7]，但亦存有争议[4,8]。Kim等[9]研究指出，不同病因的IS可能存在不同的遗传背景，忽略这种差异可能会得到矛盾的结论。基于此，本研究拟探讨COX-2基因两个基因多态性位点(-1195G>A和-765G>C)与IS及其亚型的相关性。

1 对象与方法

1.1 研究对象 于2011年12月—2013年7月连续收集入住航天中心医院(北京大学航天临床医学院)神经内科的IS患者355例。IS定义为由脑缺血而引起的突发的持续时间超过24 h的局灶性或全脑神经功能损伤，并经颅脑磁共振成像(MRI)或计算机断层扫描(CT)证实。根据1993年TOAST诊断标准[10]对IS进行病因学分型：大动脉粥样硬化性卒中(large-artery atherosclerosis，LAA)93例、心源性脑梗死(cardioembolism，CE)52例、小动脉闭塞性卒中或腔隙性卒中(small vessal occlusion，SVO)117例、其他原因(stroke of other determined etiology，SOD)43例及不明原因(stroke of undetermined etiology，SUD)50例。本研究共纳入SVO患者117例(SVO组)和LAA患者93例(LAA组)作为IS组，其中男123例、女87例，平均年龄(61.6±12.1)岁。患者均在发病5 d内入选。同期从体检中心采用简单随机抽样法选取266例体检健康者作为对照组，男160例、女106例，平均年龄(62.1±10.8)岁。排除严重感染、骨髓增生异常综合征、恶性浆细胞病、肿瘤、肝病、肾病等患者。入选受试者均为中国汉族人，并居住在北京地区。本研究协议经我院伦理协会和医院伦理委员会审查批准，受试者均签署知情同意书。

1.2 资料收集与检测指标 本研究采用病例对照研究。对受试者进行问卷调查，收集危险因素，包括高血压、糖尿病、冠心病、吸烟、饮酒、体质指数(BMI)等资料。如果患者无法沟通，通过其直系亲属采集病史资料。

于患者住院次日清晨空腹抽取肘静脉血4 ml，用全自动分析仪测定低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、三酰甘油(TG)、总胆固醇(TC)。

1.3 基因提取及分型 于患者住院次日清晨空腹抽取肘静脉血2 ml抗凝(枸橼酸钠和EDTA-K2联合抗凝)，按照DNA提取试剂盒(TIANGEN)操作，提取全血标本DNA。提取的基因组DNA于-80 ℃保存备用。运用扩增阻滞突变系统(ARMS)结合荧光探针(TaqMan)技术的方法(ARMS-TaqMan)，采用ABI公司的TaqExpress软件(ABI，Foster City，CA)设计引物和探针，由北京赛百盛生物技术公司合成。测定的基因型均通过测序法进行验证。-1195 G>A位点突变扩增片段长度119 bp，引物3′端-2位引入错配碱基“T”(正配碱基应为“A”)，-765 G>C位点突变扩增片段长度116 bp，引物3′端-2位引入错配碱基“T”(正配碱基应为“C”，见表1)。

ARMS-TaqMan法的PCR反应体系及测定条件：反应体系20 μl，包括：反应液8 μl，上、下游引物各1 μl，增强液1 μl，探针1 μl，H2O 6 μl，模板2 μl；使用7500荧光定量PCR测定仪(美国ABI公司)检测探针羧基荧光素的荧光信号。-1195 G>A、-765 G>C位点突变反应条件为94 ℃ 5min，94 ℃ 25 s、60 ℃ 35 s 40个循环，以2～9个循环为基线和阈值0.02确定循环阈值(Ct值)。

ARMS-TaqMan法检测不同基因型判定标准的建立：利用引物3′端与模板正配与错配扩增效率不同，以已知浓度梯度不同基因型质粒标准品为模板，按上述反应条件，通过荧光信号检测确定PCR反应有无指数扩增期和Ct值，确定可区分位点突变检测的浓度范围。在可区分位点突变检测的浓度范围内，记录不同拷贝数的野生引物Ct值(Wct)和突变引物Ct值(Mct)，计算两者差值Δct(Δct= Wct-Mct)，根据总体均数计算Δct的99%可信区间(Δct±2.58)及PCR扩增时有无指数增长期，建立各种等位基因型的判定标准。

表1 COX-2基因位点突变引物及探针序列

注：序列中加_的碱基是引入的错配碱基，用以增加引物特异性

2 结果

2.1 临床资料比较 IS组高血压、糖尿病患病率，吸烟率，饮酒率，BMI及TG、TC、LDL-C水平高于对照组(P<0.05)；SVO组高血压、糖尿病患病率，饮酒率，BMI及TG、TC、LDL-C水平高于对照组(P<0.05)；LAA组高血压、糖尿病患病率，饮酒率，BMI及TG、TC、LDL-C水平明显高于对照组(P<0.05)；IS组、SVO组、LAA组HDL-C水平均低于对照组(P<0.05，见表2)。

2.2 COX-2基因-1195G>A和-765G>C基因型、等位基因分布频率比较 -1195G>A和-765G>C基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡(χ2=0.757,P=0.384；χ2=3.016，P=0.082)。

对照组与IS组COX-2基因-1195G>A位点基因型分布频率及等位基因分布频率间差异无统计意义(P>0.05)。与对照组-1195G>A位点GG基因型相比，AA基因型及携带A等位基因(GA+AA)发生SVO的风险更高〔OR=2.20，95%CI(1.15，4.22)，P=0.02；OR=1.67，95%CI(1.01，2.77)，P=0.04〕；行多因素Logistic回归校正年龄、性别及传统危险因素后，仍有统计学意义〔OR=2.18，95%CI(1.05,4.51)，P=0.04；OR=1.76，95%CI(1.01,3.11)，P=0.05〕。LAA组-1195G>A位点基因型分布频率、等位基因分布频率与对照组相比，差异无统计学意义(P>0.05)。

对照组与IS组、LAA组、SVO组比较，COX-2基因-765G>C位点的基因型分布频率间差异无统计学意义(χ2=0.30，P=0.86；χ2=0.24，P=0.89)，等位基因分布频率在各组间差异亦无统计学意义(χ2=0.18，P=0.67；χ2=0.24，P=0.62，见表3)。

2.3 COX-2基因2个SNPs位点的单体型分布频率比较 连锁不平衡分析提示-1195G>A与-765G>C存在一定的连锁不平衡(D′=0.52，r2=0.13)。2个SNPs共构建G-G、G-C、A-G、A-C 4个单体型，其中单体型G-G在IS组及对照组中频率最大(48.1%和52.3%)。SVO组单体型A-G频率高于对照组(41.1% 和32.7%)，差异有统计学意义〔OR=1.44，95%CI(1.05,1.97)，P=0.02〕。IS组和LAA组与对照组单体型分布频率间差异无统计学意义(P>0.05，见表4)。

表2 各组受试者临床资料比较

注：与对照组比较,*P<0.05；●为χ2值；△为对照组与IS组比较，▲为对照组与SVO组、LAA组比较；BMI=体质指数，TG=三酰甘油，TC=总胆固醇，HDL-C=高密度脂蛋白胆固醇，LDL-C=低密度脂蛋白胆固醇

表3 各组受试者COX-2基因SNPs基因型、等位基因分布频率比较〔n(%)〕

注：▲与对照组比较

表4 各组受试者COX-2基因单体型分布频率比较〔n(%)〕

Table4 Comparison of haplotypes frequency distribution of the COX-2 gene in each group

例数单体型*G-G G-C A-G A-C对照组266278(52.3)32(6.0)174(32.7)48(9.0)IS组210202(48.1)19(4.5)159(37.9)40(9.5)OR(95%CI)0.85(0.66,1.09)0.75(0.42,1.33)1.26(0.96,1.64)1.06(0.68,1.64)P值▲0.200.320.100.80SVO组117106(45.2)9(3.9)96(41.1)23(9.7)OR(95%CI)0.75(0.55,1.03)0.64(0.30,1.36)1.44(1.05,1.97)1.09(0.64,1.84)P值▲0.070.240.020.75LAA组9396(51.7)10(5.3)63(33.8)17(9.2)OR(95%CI)0.97(0.70,1.36)0.87(0.42,1.81)1.05(0.74,1.49)1.03(0.58,1.83)P值▲0.900.700.790.92

注：*表示单体型按照-1195G >A及-765G>C列出；▲与对照组比较

3 讨论

本研究以中国汉族人群作为研究对象，探讨COX-2基因-1195G>A和-765G>C与IS及其亚型的相关性，结果显示-1195G>A和-765G>C基因型、等位基因频率及其组成单体型与IS的发生均无相关性；校正相关危险因素后仍无统计学意义。进一步探讨COX-2基因多态性与IS亚型的相关性，结果显示-1195 AA基因型及携带A等位基因(AA+GA)与SVO有关，而与LAA无关；构建单体型，结果亦显示单体型A-G与SVO相关。

人类COX-2基因位于1号染色体q25.2～q25.3，含有10个外显子和9个内含子。在基础条件下，COX-2基因表达是高度受限的，在正常生理情况下几乎不表达，但在受到内外环境刺激时可使COX-2呈过度表达。COX-2基因-765G>C位点与-1195G>A位点均位于启动子位置，既往研究表明，该位点突变能改变启动子的活性从而影响COX-2的表达[11-12]。

既往关于COX-2基因-1195G>A位点的研究多局限在炎症[13]和肿瘤[14]方面。本研究发现，与纯合野生基因GG相比，A等位基因携带者患SVO的风险更大，这个结果与Chen等[6]的结论一致。但关于此位点的研究结论仍有争议。国内学者杜丹华等[15]研究表明，该位点与IS及其亚型无相关性。Zhang等[12]研究发现，-1195G>A位点变异可以产生一个新的转录因子C-MYB结合位点，与G等位基因相比，A等位基因可以提高启动子活性及COX-2 mRNA的表达。但是，COX-2基因多态性影响SVO的确切机制尚不清楚。已有研究发现，COX-2通过调节炎性反应在血栓形成中发挥着重要作用[16]。因此，猜测-1195G>A位点A等位基因携带者的COX-2水平升高，引起PGE2水平的升高，从而通过炎性反应促进SVO的形成，但仍需进一步研究。

Cipollone等[7]研究发现，COX-2基因-765G>C位点GC和CC基因型与卒中发病率降低相关，提出C等位基因可能为减少卒中发病率的遗传保护性因子。然而，Kohsaka等[17]研究结果提示，与GG基因型相比，GC与CC基因型携带者发生卒中的可能性更大〔OR=1.34，95%CI(1.03,1.74)，P=0.03〕。本研究并未发现-765G>C位点基因型、等位基因频率与IS及其亚型相关，这与Lemaitre等[4]研究结论相一致。Li等[8]针对-765G>C与IS是否存在相关性进行了Meta分析，共纳入1 628例IS患者及17 653例对照，结果亦显示，与GG基因型相比，GC与CC基因型携带者与IS的发生无相关性〔OR=1.11，95%CI(0.88,1.06)〕。

遗传异质性可能是这些结论有争议的原因之一。首先，本研究对照组-1195G>A的基因型频率GG为32.3%，GA为51.9%，AA为15.8%，这与国内其他研究相一致(GG为24%，GA为48%，AA为29%)[15]，而与国外的研究相比该基因型分布频率差异较大(GG为5%，GA为33%，AA为62%)[18]。同样，此种差异在-765G>C位点亦较显著[19]。其次，由于IS的病因不同，遗传因素在不同亚型中发挥的作用也不同，关于这两个位点与IS的研究，既往研究多未对IS进行分型，因此可能对研究结果产生了一定的影响。

总之，本研究提示，COX-2基因-1195G>A多态性及单体型A-G与SVO相关联，但仍需扩大样本并且在不同种族之间进一步分析-1195G>A对IS及其亚型发生的影响。

1 Yang G,Wang Y,Zeng Y,et al.Rapid health transition in China,1990-2010: findings from the Global Burden of Disease Study 2010[J].Lancet， 2013，381(9882):1987-2015.

2 Matarin M,Singleton A,Hardy J,et al.The genetics of ischaemic stroke[J].J Intern Med，2010，267(2):139-155.

3 Rodriguez-Yanez M,Castillo J.Role of inflammatory markers in brain ischemia[J].Curr Opin Neurol，2008，21(3):353-357.

4 Lemaitre RN,Rice K,Marciante K,et al.Variation in eicosanoid genes,non-fatal myocardial infarction and ischemic stroke[J].Atherosclerosis， 2009，204(2):e58-e63.

5 Warner TD,Mitchell JA.Cyclooxygenases:new forms,new inhibitors,and lessons from the clinic[J].FASEB J，2004，18(7):790-804.

6 Chen GZ,Shan XY,Cheng GP,et al.Cyclooxygenase-2 genetic polymorphism and stroke subtypes in Chinese[J].J Mol Neurosci，2013，51(2):467-473.

7 Cipollone F,Toniato E,Martinotti S,et al.A polymorphism in the cyclooxygenase 2 gene as an inherited protective factor against myocardial infarction and stroke[J].JAMA，2004，291(18):2221-2228.

8 Li W,Xu J,Wang X,et al.Cyclooxygenase-2(COX-2) G-765C is a protective factor for coronary artery disease but not for ischemic stroke: a meta-analysis[J].Atherosclerosis，2009，207(2):492-495.

9 Kim Y,Lee C.The gene encoding transforming growth factor beta 1 confers risk of ischemic stroke and vascular dementia[J].Stroke，2006，37(11):2843-2845.

10 Adams HP Jr,Bendixen BH,Kappelle LJ,et al.Classification of subtype of acute ischemic stroke.Definitions for use in a multicenter clinical trial.TOAST.Trial of Org 10172 in Acute Stroke Treatment[J].Stroke，1993，24(1):35-41.

11 Her MY,El-Sohemy A,Cornelis MC,et al.Cyclooxygenase-2 polymorphisms and risk of systemic lupus erythematosus in Koreans[J].Rheumatol Int，2006，27(1):1-5.

12 Zhang X,Miao X,Tan W,et al.Identification of functional genetic variants in cyclooxygenase-2 and their association with risk of esophageal cancer[J].Gastroenterology，2005，129(2):565-576.

13 Daing A,Singh SV,Saimbi CS,et al.Cyclooxygenase 2 gene polymorphisms and chronic periodontitis in a North Indian population: a pilot study[J].J Periodontal Implant Sci，2012，42(5):151-157.

14 Guo S,Li X,Gao M,et al.Synergistic association of PTGS2 and CYP2E1 genetic polymorphisms with lung cancer risk in northeastern Chinese[J].PLoS One，2012，7(6):e39814.

15 杜丹华,吴江,高鹏,等.环氧合酶基因多态性与缺血性卒中相关性研究[J].中风与神经疾病杂志，2008，25(1):49-52.

16 Linton MF,Fazio S.Cyclooxygenase-2 and inflammation in atherosclerosis[J].Curr Opin Pharmacol，2004，4(2):116-123.

17 Kohsaka S,Volcik KA,Folsom AR,et al.Increased risk of incident stroke associated with the cyclooxygenase 2(COX-2) G-765C polymorphism in African-Americans: the Atherosclerosis Risk in Communities Study[J].Atherosclerosis，2008，196(2):926-930.

18 Vogel U,Segel S,Dethlefsen C,et al.Associations between COX-2 polymorphisms,blood cholesterol and risk of acute coronary syndrome[J].Atherosclerosis，2010，209(1):155-162.

19 Lee CR,North KE,Bray MS,et al.Cyclooxygenase polymorphisms and risk of cardiovascular events: the Atherosclerosis Risk in Communities(ARIC) study[J].Clin Pharmacol Ther，2008，83(1):52-60.