早期糖尿病肾病泛素-核糖体融合蛋白52和尿微量清蛋白关系研究

张 艳，任 荣，梁新华，张 蕾

糖尿病肾病(DN)在糖尿病人群中发病率为20%～40%，是糖尿病的主要并发症和死亡原因。近年来，随着糖尿病患者数量的快速增长，DN发病率亦逐年上升，已经成为终末期肾病(ESRD)的首位病因。因此，早发现、早治疗对于改善DN患者预后、降低医疗开支及社会经济负担有着积极作用。而尿微量清蛋白(microalbuminuria，MAU)是目前公认的诊断早期DN的标志性尿蛋白，但易受多种因素影响，如血糖、血压控制不佳、24 h内剧烈活动、全身或尿路感染、血尿、充血性心力衰竭、发热、使用非甾体抗炎药和血管紧张素转换酶抑制剂、吸烟、妊娠等[1]，使其在早期DN诊断中准确性及预测价值降低。

DN是以肾小球系膜细胞病变为主的疾病，内皮细胞损伤和足细胞丢失在DN发病过程中起关键作用。近期研究发现，相对于肾小球病变，肾小管病变与肾功能恶化有更密切的关系[2]。肾小管间质改变并非继发于肾小球病变，而是DN早期病变和原始特征之一[3-6]。近年来，随着蛋白质组学技术在生物医学领域的广泛应用，研究者已经开始利用蛋白质组学技术筛选出能更早、更准确地预测或诊断DN病情进展与监测预后的生物标志物。Dihazi等[7]研究DN及糖尿病合并其他肾病患者尿液蛋白质谱发现，DN患者尿液特异性表达质核比为14∶766，并提出该蛋白可作为DN诊断性尿蛋白；后证实该蛋白为泛素-核糖体融合蛋白52(UBA52)，DN可通过高糖和各种应激反应激活相应增强子，加强转录，表达UBA52[8-9]。本研究通过检测血UBA52、尿UBA52、MAU及尿蛋白定量等指标，初探早期DN患者UBA52的表达及其与MAU的关系。

表1 3组临床资料比较

注：与对照组比较，*P<0.05；与糖尿病组比较，△P<0.05；▲为χ2值

表2 3组血UBA52、尿UBA52、尿蛋白定量和MAU比较

注：与对照组比较，*P<0.05；与糖尿病组比较，△P<0.05；UBA52=泛素-核糖体融合蛋白52，MAU=尿微量清蛋白

1 资料与方法

1.1 纳入标准 (1)年龄≥18岁，血肌酐<265 μmol/L，自愿参加试验；(2)符合2010年《中国2型糖尿病防治指南》中的糖尿病诊断标准，且尿蛋白肌酐比率(ACR)≥30 μg/mg。

1.2 排除标准 (1)合并发热、肿瘤、妊娠、充血性心力衰竭；(2)DN患者内生肌酐清除率≥265 μmol/L，其他原因所致的肾脏损害，如高血压肾损害、原发性肾炎、肾病综合征、IgA肾病。

1.3 一般资料 选取2012年2月—2013年3月新疆医科大学第五附属医院收治的糖尿病患者20例(糖尿病组)，DN患者59例(DN组)。另选取同期在本院体检健康者22例作为对照组。

1.4 方法

1.4.1 血标本采集 于清晨空腹状态下采集3组受试者静脉血3 ml，分别装入免疫管和生化管。

1.4.2 尿标本采集 尿标本：空腹8 h后晨起采集第1次清洁中段尿5 ml。尿蛋白定量标本：试验前24 h禁服利尿剂，留取24 h尿，期间保持适当的水分摄入，禁服咖啡、茶等利尿性物质，准确计量全部尿量(ml)。

1.4.3 MAU、UBA52检测方法 采用免疫透射比浊法检测3组受试者MAU，检测仪器为BECKMAN 8000，由同一名经验丰富的检验医师检验；采用ELISA法检测3组受试者UBA52，试剂盒购自北京华夏远洋公司，酶标比色计波长为450 nm，由3名培训合格的研究人员进行检验操作。

2 结果

2.1 3组临床资料比较 3组性别、年龄、BMI比较，差异均无统计学意义(P>0.05)；3组血糖、糖化血红蛋白、总胆固醇比较，差异均有统计学意义(P<0.05)，其中DN组血糖、糖化血红蛋白、总胆固醇均高于对照组，糖尿病组血糖和糖化血红蛋白均高于对照组，DN组糖化血红蛋白和总胆固醇均高于糖尿病组，差异有统计学意义(P<0.05，见表1)。

2.2 3组血UBA52、尿UBA52、尿蛋白定量和MAU比较 3组血UBA52、尿UBA52、尿蛋白定量和MAU比较，差异均有统计学意义(P<0.05)，其中DN组血UBA52、尿UBA52、尿蛋白定量和MAU均高于对照组和糖尿病组，糖尿病组尿蛋白定量、MAU均高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05，见表2)。

2.3 多元线性回归分析 以DN患者尿UBA52为因变量，以血糖、糖化血红蛋白、总胆固醇、MAU为自变量，进行多元线性回归分析，结果显示，MAU和糖化血红蛋白进入回归方程(P<0.05，见表3)。

表3 DN患者尿UBA52水平影响因素的多元线性回归分析

Table3 Multiple linear regression analysis on influencing factors for urine UBA52 in DN patients

偏回归系数标准偏回归系数t值P值常数项-2306-06240536MAU 0018 039042570000糖化血红蛋白 1614 025427710007

3 讨论

糖尿病是全球最常见的慢性病之一，已成为重大的社会卫生问题。据统计，至2010年全球糖尿病患者达2.8亿，预计其每年增长率为2.2%。发展中国家传统生活方式改变、糖尿病诊断标准改变、公众意识提高、总体人群病死率下降、肥胖率增加等，均会导致2型糖尿病的发生。WHO调查显示，到2025年，中国和印度将有1.3亿糖尿病患者，将消耗医疗预算的40%，严重阻碍经济的发展。DN是常见的糖尿病微血管病并发症，临床上以微量清蛋白尿到大量蛋白尿为主要表现。在美国，30%～40%的DN由糖尿病导致[10]。然而，DN发病机制尚未完全清楚，临床治疗措施有限。2013年，本科住院患者DN患病率达17.8%，而40%的DN患者在住院开始即进行血液透析。目前就DN的诊断而言，传统的肾活检由于具有一定的创伤性，限制了其临床应用，而尿清蛋白的检测又存在特异度不高的缺陷[11-12]。因此，筛选早期、更准确的DN生物标志物不仅有助于更好地阐明DN的发生机制，且对DN的早期诊断、治疗效果的检测及预后的判断均具有重大意义。最新研究发现，相对于肾小球病变，肾小管病变对肾功能恶化有更密切的关系，故选择UBA52，其表达在肾小管，且证实与DN进展密切相关[13]。DN可以通过高糖和各种应激反应激活相应增强子，加强转录，表达UBA52，在泛素水解酶的作用下可水解释放大量游离泛素分子维系泛素-蛋白酶体途径(ubiquitin-ptoteasome path，UPP)的活性[14]。UPP是真核生物降解蛋白质的主要途径，80%～90%的蛋白质被泛素蛋白酶系统降解。国内外多项研究提示，UPP参与了DN肾脏纤维化多条信号通路中重要蛋白分子，如转化生长因子-β(TGF-β)、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)、核因子-κB(NF-κB)负调节因子的降解[15-16]，引起信号通路的过度持久活化，对肾小球系膜细胞凋亡、抗原提呈、炎性演进和基因转录等多方面进行上调或下调，并促进肾脏纤维化，在DN的进展中起到重要作用。因UPP在DN患者中特异性表达，故其可以提高诊断早期DN的特异度。

本研究分别测定3组患者血UBA52、尿UBA52、尿蛋白定量及MAU等指标。结果显示，DN组血UBA52、尿UBA52显著高于糖尿病组和对照组，而糖尿病组与对照组比较无差异，具有干扰因素少、取材方便、无创性等优势；而DN组和糖尿病组MAU均高于对照组，故在DN早期缺乏特异性。本研究结果亦显示，MAU和糖化血红蛋白水平升高可增加UBA52水平。近年来，许多研究证明，肾小管损伤在DN发生发展中起着重要作用。DN肾小管损伤的主要病理表现是小管细胞增生、肥大、萎缩、凋亡、转分化等改变，同时肾小管周围有炎性细胞浸润及不同程度肾小管间质纤维化，重视并深入研究DN小管细胞损伤的机制对防治DN进展具有重要意义。动态监测尿UBA52，并对DN按照肾小球滤过率(GFR)进行分期，检测其与肾小球滤过功能的关系，在给予血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂(ARB)干预，评价其是否可作为临床疾病转归的指标具有重要意义。

1 汪年松.继发性肾脏病[M].北京：科学技术文献出版社，2009：181-183.

2 Phillips AO，Steadman R.Diabetic nephropathy：the central role of renal proximal tubular cells in tubulointerstitial injury[J].Histol Histopathol，2002，17(1)：247-252.

3 Tang SC，Leung JC，Lai KN.Diabetic tubulopathy：an emerging entity[J].Contrib Nephrol，2011，170：124-134.

4 Kanwar YS，Sun L，Xie P，et al.A glimpse of various pathogenetic mechanisms of diabetic nephropathy[J].Annu Rev Pathol，2011，6：395-423.

5 Najafian B，Kim Y，Crosson JT，et al.Atubular glomeruli and glomerulotubular junction abnormalities in diabetic nephropathy[J].J Am Soc Nephrol，2003，14(4)：908-917.

6 Dalla Vestra M，Saller A，Bortoloso E，et al.Structural involvement in type 1 and type 2 diabetic nephropathy[J].Diabetes Metab，2000，26(Suppl 4)：8-14.

7 Dihazi H，Müller GA，Lindner S，et al.

Characterization of diabetic nephropathy by urinary proteomic analysis：identification of a processed ubiquitin form as a differentially excreted protein in diabetic nephropathy patients[J].Clin Chem，2007，53(9)：1636-1645.

8 Sun L，Pan X，Wada J，et al.Isolation and functional analysis of mouse UbA52 gene and its relevance to diabetic nephropathy[J].J Biol Chem，2002，277(33)：29953-29962.

9 Wada J，Sun L，Kanwar YS.Discovery of genes related to diabetic nephropathy in various animal models by current techniques[J].Contrib Nephrol，2011，169：161-174.

10 Caramori ML，Fioretto P，Mauer M.Enhancing the predictive value of urinary albumin for diabetic nephropathy[J].J Am Soc Nephrol，2006，17(2)：339-352.

11 Sun L，Pan X，Wada J，et al.Isolation and functional analysis of mouse UbA52 gene and its relevance to diabetic nephropathy[J].J Biol Chem，2002，277(33)：29953-29962.

12 热衣汉·西里甫，帕提古丽·阿斯讨拜，桑晓红.糖尿病肾病患者尿微量清蛋白相关因素研究[J].中国全科医学，2012，15(8)：2755.

13 Yin ST，Huang H，Zhang YH，et al.A fluorescence assay for elucidating the substrate specificities of deubiquitinating enzymes[J].Biochem Biophys Res Commun，2011，416(1/2)：76-79.

14 Liu FY，Li XZ.The roles of Arkadia in renal tubular epithelial to mesenchymal transition[J].Med Hypotheses，2006，67(5)：1205-1207.

15 Huo LJ，Fan HY，Zhong ZS，et al.Ubiquitin-proteasome pathway modulates mouse oocyte meiotic maturation and fertilization via regulation of MAPK cascade and cyclin B1 degradation[J].Mech Dev，2004，121(10)：1275-1287.

16 Feng B，Zhang YQ，Mu J，et al.Uraemic serum induces dysfunction of vascular endothelial cells：role of ubiquitin-proteasome pathway[J].Exp Physiol，2011，96(8)：801-815.