循环肿瘤细胞预测肝细胞癌患者临床预后价值的Meta分析

曹宇勃，许崇安

肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是最常见的恶性肿瘤之一，发病率居全球恶性肿瘤第6位，病死率高居第3位[1-2]。我国是乙型肝炎大国，约有3 000万慢性病毒性肝炎患者，而慢性病毒性肝炎可逐渐演变为肝硬化，其中90%左右的肝硬化患者晚期可合并肝癌，我国已成为全世界肝癌高发地区之一[3-5]。与肝癌发生相关的主要危险因素有酗酒、黄曲霉素摄入、乙型肝炎病毒(HBV)感染和丙型肝炎病毒(HCV)感染等[6-7]。随着人类基因组学对肝脏肿瘤分子机制研究的不断深入，人们已经意识到肝癌的发生与发展是个极其复杂的病理生理过程，与多种基因突变及其表观遗传学改变有关[8-9]。

循环肿瘤细胞(circulating tumor cells，CTCs)指脱离了原发病灶，侵袭并进入血液循环的癌细胞，也称之为“播撒肿瘤细胞”(disseminated tumor cells，DTCs)。早在1869年，澳大利亚学者Ashworth就发现死于转移癌患者的血液中存在一种与原发肿瘤细胞相似的细胞，由此首次提出了CTCs的概念[9-10]。相关研究证实，CTCs的存在可能是恶性肿瘤在远处形成转移性病灶的中间过程，与患者的临床预后有着密切关系[11]。近年来，敏感分子技术的发展使分离和计数外周血中的CTCs成为可能。在疾病早期阶段，CTCs有助于良、恶性肿瘤的鉴别，转移风险的预测和判断；在疾病进展期，CTCs能提供重要的预后信息，有助于医生监测治疗效果。此外，CTCs能反映肿瘤特征，指导治疗方案的制定，故可以作为靶向治疗的靶标[12]。大量研究表明，外周血CTCs是预测HCC患者预后的可靠生物学指标，可在治疗过程中及时有效地监测HCC患者临床治疗效果并可随时预测疾病进展情况和患者预后生存期[12-13]。然而，也有部分研究认为外周血CTCs对于预测HCC患者预后临床意义不大[14]。鉴于既往研究的争议性结果，本Meta分析通过全面收集相关研究来评价外周血CTCs预测HCC患者临床预后的真实价值，以期为HCC的临床诊断和治疗提供参考依据和帮助。

1 资料与方法

1.1 资料检索 计算机检索PubMed、EMBase、Web of Science、Cochrane Library、CISCOM、CINAHL、Google学术、中国生物医学文献数据库(CBM)和中国知网等中英文数据库，手工检索相关参考文献，检索时间从其建库至2013-08-01，文献检索策略采用主题词和自由词结合的原则，检索词主要包括：循环肿瘤细胞、circulating tumor cells、embolic tumor cells、disseminated tumor cells、肝癌、hepatocellular carcinoma、HCC、prognosis、预后、survival、生存期等。手工检索纳入文献的参考文献以发现潜在符合纳入标准的研究。

1.2 纳入与排除标准 文献纳入标准：(1)外周血CTCs预测HCC患者预后的临床研究。(2)患者均经病理组织学证实为HCC；(3)纳入文献均提供完整的HCC患者预后的数据资料如总生存期(OS)、无复发生存期(RFS)、无病生存期(DFS)等；(4)语言均为中文或英文。不符合上述纳入标准的文献将被剔除。同一作者采用相同病例进行了多项研究并发表，则仅纳入样本量最大的研究或者最近发表的研究。

1.3 数据提取 采用统一制定的数据收集表，由两位研究者分别独立提取纳入文献数据资料，主要数据信息包括：第一作者、发表时间、国家、种族、诊断、性别、检测方法、CTCs表达情况、结局指标。如存在争议，通过与第三方讨论解决分歧。

1.4 纳入文献质量评分 由两位研究者根据NOS(Newcastle-Ottawa Scale)分别对纳入文献的质量进行评价[15]。NOS满分为 9 分，包括观察组和对照组研究对象的定义和选择、两组的可比性、暴露因素3方面内容。≥7分为高质量。

1.5 统计学方法 采用STATA 12.0(Stata Corp，College Station，TX，USA)软件进行。采用固定效应模型或随机效应模型计算危险比(HR)及其95%可信区间(95%CI)评价CTCs阳性和CTCs阴性HCC患者预后差异，并对合并效应值进行Z检验。各研究间异质性采用CochranQ检验进行评价，若P<0.05则提示异质性差异有统计学意义[16]；此外，采用I2检验定量评价异质性大小，I2值介于0%～100%[17]，I2值越大提示异质性越明显；如异质性检验P<0.05或I2>50%则提示各研究间存在异质性，故采用随机效应模型(DerSimonian Laird法)分析，反之则采用固定效应模型(Mantel-Haenszel法)分析。根据种族、临床诊断和检测方法进行了亚组分析以探究各组间异质性来源，并逐一删除纳入研究进行敏感性分析以评价单一研究对总体结果的影响。采用Begger漏斗图和Egger线性回归分析纳入文献是否存在发表偏移以评价原始分析结果的真实可靠性[18]。

2 结果

2.1 纳入研究的基线特征 最初检索到相关文献385篇，根据其题目和关键词剔除208篇，进一步阅读摘要和全文后剔除165篇，最终12项队列研究符合纳入标准进入本Meta分析[19-30]。纳入研究的发表时间1997—2013年。文献纳入筛选流程见图1。过去十年电子数据库中与主题相关的文献数量的分布见图2。纳入的12项研究包括1 133例HCC患者，其中CTCs阳性患者559例和CTCs阴性患者574例。8项来自于欧美人群，其余4项来自于亚洲人群。8项采用实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)法检测外周血CTCs表达情况，其余4项采用CellSearch法进行检测。12项纳入文献总体质量较高，除1项研究质量评分为5分之外，其余研究质量评价均≥6分。纳入研究的基线特征和质量评价见表1。

2.2 Meta分析结果 各研究间存在异质性(均I2>50%，P<0.05)，故采用随机效应模型分析。Meta分析结果显示：CTCs阳性HCC患者的OS和RFS短于CTCs阴性患者，差异有统计学意义〔OS：HR=1.53，95%CI(0.98，2.07)，P<0.001；RFS：HR=3.14，95%CI(0.70，5.58)，P=0.012〕。CTCs阳性患者与CTCs阴性患者的DFS差异无统计学意义〔HR=1.35，95%CI(-0.75，3.46)，P=0.207,见图3〕。

根据种族不同进行亚组分析发现，欧美人群和亚洲人群CTCs阳性患者OS与RFS均短于CTCs阴性患者，差异有统计学意义〔欧美人群：HR=2.09，95%CI(1.29，2.89)，P<0.001；亚洲人群：HR=1.14，95%CI(0.65，1.64)，P<0.001,见图4〕。

根据临床诊断不同进行亚组分析显示，CTCs阳性的原发性和继发性HCC患者OS与RFS均短于CTCs阴性患者，差异有统计学意义〔原发性HCC：HR=1.14，95%CI(0.70，1.57)，P<0.001；继发性HCC：HR=2.54，95%CI(1.54，3.55)，P<0.001，见图5〕。

根据不同检测方法进行亚组分析发现，在qRT-PCR 和CellSearch 亚组中CTCs阳性患者OS与RFS均短于CTCs阴性患者，差异有统计学意义〔qRT-PCR：HR=1.36，95%CI(0.87，1.86)，P<0.001；CellSearch：HR=2.57，95%CI(1.19，3.94)，P<0.001，见图6〕。

图1 文献筛选流程图

图2 外周血CTCs预测HCC患者临床预后相关文献的年限分布图

Figure2 Distribution of the number of years of topic-related literatures in the electronic database

注：RFS=无复发生存期,OS=总生存期,DFS=无病生存期

图3 CTCs阳性与CTCs阴性HCC患者的RFS、OS、DFS比较

Figure3 Comparison of RFS,OS and DFS between the CTCs-positive and CTCs-negative HCC patients

2.3 敏感性分析与发表偏移 采用单因素及多因素回归分析探讨异质性来源，结果表明任何因素均不是异质性的主要来源(均P>0.05,见表2)。逐一删除纳入研究进行敏感性分析以评价单一研究对总体结果的影响，结果表明无单一研究可显著影响原始分析和亚组分析结果的差异(见图7)。Begger漏斗图图形对称，提示无明确发表偏移(见图8)。Egger线性回归分析进一步证实纳入文献无发表偏移(t=-0.68，P=0.513)。

3 讨论

CTCs是自发或因诊疗操作由实体瘤或转移灶释放进入外周血循环的肿瘤细胞[31]。大部分肿瘤细胞进入循环系统后被免疫系统识别并清除，但是少量肿瘤细胞会获得新的特征而在血液中存活，这些细胞即是CTCs；未被清除的CTCs通过迁移、黏附、相互聚集形成微小癌栓，并在一定条件下发展为转移灶[32]。既往研究表明，外周血中CTCs的含量与恶性肿瘤的治疗效果和预后有密切的关系。HCC是世界上最常见的恶性肿瘤之一，全世界每年有564 000例新发病例，其5年生存率不足5%[33-35]。因此，寻找方便、快速、准确的生物标志物以早期诊断HCC、预测HCC患者临床治疗疗效及预后已成为近年来的研究热点[36]。最新研究表明，外周血CTCs可作为HCC疗效评估指标及加强辅助化疗的选择性指标，有助于建立个体化治疗方案，从而降低HCC复发率，延长患者生存期，使HCC的综合治疗更加及时、完善、有效[37]，但该观点尚存在争议。

表1 纳入文献基线特征与质量评分

注：CTCs=循环肿瘤细胞，HCC=肝细胞癌，qRT-PCR=实时荧光定量聚合酶链反应,RFS=无复发生存期,OS=总生存期,DFS=无病生存期

表2 异质性来源单因素及多因素回归分析结果

Table2 Univariate and multivariate regression analyses of potential source of heterogeneity

因素偏回归系数标准误Z值P值95%CI年限 单因素-01670096-1740083(-0356，0022) 多因素-01640122-1350178(-0403，0075)国家 单因素003603570100919(-0663，0736) 多因素160310291560120(-0415，3620)种族 单因素045710110450652(-1525，2438) 多因素-15690769-1220072(-1917，1222)诊断 单因素071109380760448(-1128，2550) 多因素178414021410160(-0075，3493)检测方法 单因素151108061870061(-0070，3091) 多因素197509522050058(-0129，3820)生存期 单因素016106130260793(-1041，1362) 多因素-05870469-1250210(-1506，0332)

图4 不同种族CTCs阳性与CTCs阴性患者预后比较

Figure4 Comparison of prognosis between CTCs-positive and CTCs-negative HCC patients of different ethnicity

图5 不同临床诊断CTCs阳性与CTCs阴性患者预后比较

Figure5 Comparison of prognosis between CTCs-positive and CTCs-negative patients with primary and metastatic HCC

图6 不同检测方法CTCs阳性与CTCs阴性患者预后比较

Figure6 Comparison of prognosis between CTCs-positive and CTCs-negative HCC patients with different detection method

图7 单一研究对总体结果影响的敏感性分析结果

Figure7 Sensitivity analysis of the influence of each individual study on the pooled HRs by omitting individual studies

图8 评价发表偏移的Begger倒漏斗图

Figure8 Begger′s funnel plots of the potential publication bias of included studies

本Meta分析评价外周血CTCs预测HCC患者预后，共计12项队列研究被纳入，Meta分析结果显示，外周血CTCs阳性患者的OS与RFS低于CTCs阴性患者，提示外周血CTCs可能与HCC患者临床预后有着密切关系。众所周知，CTCs可在血液中形成微小癌栓，并在一定条件下发展为转移病灶，加快肿瘤的进展。已有研究表明，部分肝癌患者肝癌切除或肝移植前，已有肿瘤细胞脱落进入血循环系统中，从而导致肝癌血行转移[6]。虽然HCC的具体发病机制尚不明确，但已有研究表明外周循环血中CTCs的检测及评估可以指导HCC治疗、预测预后、判断治疗效果、监测肿瘤的转移或复发，是一种具有高度可行性的、信息含量高的新型诊断手段[38]。亚组分析结果表明，亚洲人群和欧美人群CTCs阳性患者预后均差于CTCs阴性患者，提示CTCs预测HCC患者预后无明显种族差异，适合各种人群HCC患者的疗效预测及预后判定。以上结果与既往研究结果基本一致，提示CTCs可作为预测HCC患者预后重要的生物学指标。

然而本研究也存在一定的局限性：首先，纳入文献过少可能影响本Meta分析结果的统计效能，故仍需大样本量进一步证实。其次，作为回顾性研究，Meta分析可能存在选择性偏移，从而影响研究结果的可信度。再次，由于无法获取纳入研究的原始数据，因而限制了CTCs检测对HCC患者预后价值的深入探讨。尽管纳入研究均有明确的纳入标准，但仍存在未考虑到的潜在因素影响分析结果。因此，需进一步扩大样本量来探讨CTCs对HCC患者预后的预测价值。

综上所述，现有证据表明：CTCs阳性HCC患者的OS和RFS均劣于CTCs阴性患者。检测外周血中CTCs对判断HCC的临床预后具有重要意义。本研究结论初步阐释了外周血CTCs表达情况与HCC临床预后的关系，为深入了解HCC疾病进展的具体机制提供了线索；同时，也为HCC的早期诊断、治疗指导及预后判断提供了理论依据。

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