性激素对雄性非酒精性脂肪性肝炎小鼠的影响研究

辛光大，秦少游，王江滨

非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis，NASH)是世界范围内分布的常见的慢性肝病，可进展为肝硬化和肝细胞癌[1-4]。寻找NASH发生、发展的危险因素，探讨其防治策略是目前国内外肝病学界的研究热点之一。流行病学调查显示，不同性别、不同年龄段人群NASH发生率有明显差异[5]，并推测性激素种类及其水平在NASH的性别差异中起重要作用，性别干预可能会对NASH的进展产生影响，但目前的研究结论尚存在争议。本研究通过建立蛋氨酸-胆碱缺乏(methionine-choline-deficient，MCD)饮食诱导C57BL/6雄性NASH小鼠模型[6]，观察其血清性激素水平、肝脏病理组织学表现及相关生化指标变化，旨在探讨性激素对NASH小鼠的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物 选用14周龄C57BL/6雄性小鼠50只(购自吉林大学实验动物中心)，常规饲养于吉林大学实验动物中心清洁级动物房，12 h光照和黑夜循环，温度(22±2)℃，湿度50%～60%。采用随机数字表法将50只小鼠分为对照组、MCD组、睾丸切除组、睾丸切除+雄激素组、睾丸切除+雌激素组5组，每组10只。

1.2 方法 对照组和MCD组小鼠行假手术，睾丸切除组、睾丸切除+雄激素组、睾丸切除+雌激素组小鼠行睾丸切除术，恢复2 d后，对照组小鼠饲喂MCD对照饮食(Research Diets公司生产，A02082003B)，其余4组小鼠饲喂MCD饮食(Research Diets公司生产，A02082002B)，建立MCD诱导C57BL/6雄性NASH小鼠模型，自由摄取水及食物。性别干预：睾丸切除+雄激素组小鼠皮下注射丙酸睾酮(5 mg·kg-1·d-1，溶于橄榄油，Sigma公司生产，T1875)，睾丸切除+雌激素组小鼠皮下注射苯甲酸雌二醇(0.5 mg·kg-1·d-1，溶于橄榄油，Sigma公司生产，E8515)。造模4周后所有小鼠禁食/水12 h，摘眼球取血，并颈椎脱臼处死。

1.3 观察指标 (1)小鼠肝左叶固定部位取材，行HE染色及Masson染色观察肝脏组织炎症活动度和纤维化程度；行锇酸染色观察肝细胞脂肪变性情况，采用Olympus摄像系统进行观察和摄片。(2)由两人双盲行病理组织学检查，根据美国国立卫生研究院NASH临床研究网络病理工作组指南行非酒精性脂肪性肝病活动度评分(NAFLD activity score，NAS)[7]：①肝细胞脂肪变评分：肝实质内脂肪变肝细胞占总细胞的比例<5%计0分；5%～33%计1分；34%～66%计2分；>66%计3分。②小叶内炎症评分：200倍光镜下计数坏死灶，无计0分，<2个计1 分，2～4个计2分，>4个计3分。③肝细胞气球样变：无计0分，少见计1分，多见计2分。以上3项计分之和即为NAS总分。(3)血清睾酮、雌二醇、ALT、AST水平：所有小鼠摘眼球取血，置于离心管中，静置待血液凝固后，3 000 r/min离心10 min，离心半径为13.5 cm，取上清液，采用ELISA法测定血清睾酮、雌二醇水平(CSB-E05109m和CSB-E05098m试剂盒购自美国Cusabio公司)，采用全自动生化分析仪测定血清ALT、AST水平。

2 结果

2.1 染色结果及NAS总分 对照组小鼠肝组织形态、结构均正常；MCD组、睾丸切除组、睾丸切除+雄激素组、睾丸切除+雌激素组小鼠肝小叶各区肝细胞内均有大量脂肪空泡，汇管区及小叶内可见灶状炎性细胞浸润，以淋巴细胞浸润为主，偶可见肝细胞气球样变，MCD组小鼠肝细胞脂肪变性及小叶内炎性细胞浸润最明显(见图1)。5组小鼠NAS总分比较，差异有统计学意义(χ2=36.724，P=0.000)，其中MCD组、睾丸切除组、睾丸切除+雄激素组、睾丸切除+雌激素组NAS总分秩均值大于对照组，睾丸切除组、睾丸切除+雌激素组NAS总分秩均值小于MCD组，睾丸切除+雌激素组NAS总分秩均值小于睾丸切除组、睾丸切除+雄激素组，差异均有统计学意义(P<0.05，见表1)。

2.2 血清睾酮、雌二醇、ALT、AST水平 5组小鼠血清睾酮、雌二醇、ALT、AST水平比较，差异均有统计学意义(P<0.05)。睾丸切除组和睾丸切除+雌激素组小鼠血清睾酮水平低于对照组、MCD组、睾丸切除+雄激素组，睾丸切除+雌激素组小鼠血清雌二醇水平高于对照组、MCD组、睾丸切除组、睾丸切除+雄激素组，差异均有统计学意义(P<0.05)；MCD组、睾丸切除组、睾丸切除+雄激素组、睾丸切除+雌激素组小鼠血清ALT、AST水平高于对照组，睾丸切除组小鼠血清ALT、AST水平低于MCD组，睾丸切除+雌激素组小鼠血清ALT、AST水平低于MCD组、睾丸切除组、睾丸切除+雄激素组，差异均有统计学意义(P<0.05，见表2)。

表1 5组小鼠NAS总分比较

注：与对照组比较，*P<0.05；与MCD组比较，△P<0.05；与睾丸切除组比较，▲P<0.05；与睾丸切除+雄激素组比较，☆P<0.05

Table2 Comparison of serum testosterone，estradiolin，ALT and AST in the five groups

组别例数睾酮(ng/ml)雌二醇(pmol/L)ALT(U/L)AST(U/L)对照组10631±081 350±044 335±50 411±52 MCD组10635±060 350±037 1094±104∗ 1142±68∗ 睾丸切除组10018±004∗△☆ 339±035 953±63∗△ 1042±84∗△ 睾丸切除+雄激素组10621±063 339±030 1022±104∗ 1103±77∗ 睾丸切除+雌激素组10018±005∗△☆2185±217∗△▲☆ 753±63∗△▲☆ 821±58∗△▲☆ F值3862910658214441930P值0000000000000000

注：与对照组比较，*P<0.05；与MCD组比较，△P<0.05；与睾丸切除组比较，▲P<0.05；与睾丸切除+雄激素组比较，☆P<0.05

图1 5组小鼠肝脏组织染色结果(×200)

3 讨论

随着肥胖症及代谢综合征在全球范围内的流行，非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)迅速增长并呈低龄化发病趋势。NAFLD包括非酒精性单纯性脂肪肝(NAFL)、NASH及其相关肝硬化和肝细胞癌，NASH是NAFL向肝硬化转化的必经阶段，是隐源性肝硬化的重要原因之一。NASH预后不佳，部分患者可进一步进展为肝硬化、肝细胞癌。寻找NASH发生、发展的危险因素及阻断其进一步进展的保护性因素，探讨其防治策略是目前国内外肝病学界的研究热点之一。

流行病学调查结果显示，NASH在不同的年龄段人群具有不同的性别易感性，性激素种类及其水平在NASH的性别差异中起重要作用，性别干预可能会对NASH的进展产生影响，但目前的研究结论尚存在争议。Tian等[8]对男性人群进行的研究表明雄激素与NASH无关，而Mu等[9]和Zhang等[10]在大鼠动物模型中发现雄激素对NASH有保护作用。目前关于雌激素对NASH的作用还存在较多的争议，Kamada等[11]认为雌激素对NASH具有保护作用，而Kashireddy等[12]则认为雌激素对NASH无明显影响，还可能是促进NASH进展的因素[13]。由于上述实验研究是在不同的人群和/或动物模型中进行的，其发病机制不尽相同，因此所得结论也存在一定的局限性。

本研究观察了性别干预对MCD饮食诱导C57BL/6雄性NASH小鼠的影响，研究结果显示，睾丸切除组小鼠NAS总分秩均值小于MCD组，血清睾酮、ALT、AST水平均较MCD组降低，但睾丸切除+雄激素组小鼠与MCD组和睾丸切除组小鼠NAS总分秩均值，血清睾酮、ALT、AST水平间无差异，这与黄承飞等[14]研究结论不一致，其认为雄激素对NASH具有保护作用，分析原因可能与研究所采用的动物模型不同有关，提示雄激素在不同的NASH动物模型中的作用途径是不同的。值得注意的是，雄性小鼠去势后NASH病情程度有所减轻，但补充雄激素后NASH病情程度却无明显加重，目前其确切作用机制尚不清楚，考虑是在MCD饮食诱导NASH小鼠模型中，雄激素可能通过肝细胞脂变、炎症等多条途径发挥作用，是多因素参与的。本研究结果还显示，睾丸切除+雌激素组小鼠NAS总分秩均值小于MCD组、睾丸切除组、睾丸切除+雄激素组，血清ALT、AST水平均低于MCD组、睾丸切除组、睾丸切除+雄激素组，提示雌激素可改善MCD饮食诱导C57BL/6雄性NASH小鼠病情严重程度，但其具体作用机制较为复杂，同样也是多因素参与的，需在今后的研究中进一步深入分析NASH的性别差异及其机制，寻找NASH的保护性因素，不断探讨新的防治策略。

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10 Zhang H，Liu Y，Wang L，et al.Differential effects of estrogen/androgen on the prevention of nonalcoholic fatty liver disease in the male rat[J].J Lipid Res，2013，54(2)：345-357.

11 Kamada Y，Kiso S，Yoshida Y，et al.Estrogen deficiency worsens steatohepatitis in mice fed high-fat and high-cholesterol diet[J].Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol，2011，301(6)：G1031-1043.

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14 黄承飞，董冰.性激素对非酒精性脂肪变性肝炎(NASH)的保护作用研究[J].中国畜牧杂志，2008，44(23)：20-23.