加味当归补血汤抗肾脏纤维化的实验研究*

魏明刚，何伟明，刘 蔚，顾冬梅，李凤玲，陆 迅，张新苹，杨彦裕，孙 伟△

(1.苏州大学附属第一医院，苏州 215006； 2.江苏省中医院肾科，南京 210029)

由于各种病因导致细胞外基质(ECM) 在肾脏的异常积累和沉积可以诱发肾纤维化的发生和肾瘢痕形成[1，2],这是一个导致肾功能衰竭的主要病理变化。应用阿霉素(ADR) 诱发的阿霉素肾病大鼠模型是公认的慢性肾脏疾病病变模型之一。阿霉素诱导肾病模型与肾纤维化密切相关,其病理改变包括肾小球硬化症(GS)和肾间质纤维化(RIF)[3]。肾纤维化相关肾病是一个复杂的病理过程，其中涉及异常合成、分解代谢ECM和炎症相关的细胞因子(ICF)[4～6]。基质金属蛋白酶(MMPs)是一个特定群体的锌依赖性蛋白水解酶，负责细胞外基质的代谢过程[4]。基质金属蛋白酶组织抑制剂(TIMPs)是特定切断基质金属蛋白酶的抑制剂。最新的研究表明,基质金属蛋白酶尤其是MMP-9在肾脏的ECM代谢过程中发挥着重要调控作用[5～7]。另外，大量的蛋白尿可能是肾功能恶化和导致异常合成和分解代谢ECM和ICF的重要因素。本研究旨在控制或延缓ECM和ICF的病情，从而可能有利于缓解肾脏纤维化的进展。在我们前面的相关研究工作基础上[8],报道了QGYS可以同时减少阿霉素肾病大鼠的蛋白尿和尿NAG酶。而目前的研究旨在探索QGYS治疗肾病的作用机制,特别是抗纤维化的效果和控制ECM的积聚。

1 材料与方法

1.1 药品、试剂与仪器

阿霉素购自浙江海正药业有限公司，当归、黄芪和川芎等药物购自苏州天灵制药有限公司，贝那普利(洛汀新®)购自诺华中国公司，所有其他用于研究的化学物质和溶剂均为分析纯。制备QGYS的方法。药物按照一定的比例煎煮,然后将煎煮的药液调整为最终浓度1 g/ml。

蛋白免疫印迹检测系统由Amersham, Arlington Heights, IL公司提供，TIMP-1购自美国Chemicon有限公司，IV型胶原、纤连蛋白(FN)和兔抗鼠生物素化的二抗免疫球蛋白购自北京中山金桥公司，Trizol试剂购自美国GIBCO公司，辣根过氧化物酶(HRP)耦合的抗体,anti-β-tubulin单克隆抗体和二抗购自美国Santa Cruz公司，全自动生化仪来自OLYMPUS的AU-2700， 病理图像分析系统来自德国的莱卡公司。

1.2 实验动物与方法

32只雄性SD大鼠体质量(140±10 g)，购自从中国科学院上海实验动物中心(SCXK(上海市)2012-0002),并被安置在标准的温度条件下(23±1℃)、相对湿度(55%±10%)和12 h光/12 h暗周期, 可以随意获取食物和水。老鼠按照按随机数字表法分为空白对照、模型、贝那普利和QGYS组4组,每组8只。除空白组老鼠外,其他组大鼠均给予阿霉素(7.5 mg/kg)通过尾静脉注射。

大鼠灌胃治疗包括清洁水、贝那普利或QGYS给予对应组别的大鼠，治疗时间为8周,每天1次。贝那普利和QGYS使用与人类等效剂量的药物，分别是10 mg/kg/d(10 mg/kg/d)和1 g/kg/d(2 mg/kg/d)。QGYS的剂量也对应于在我们的初步实验中抑制TGF-β1 mRNA的表达最低有效剂量。相对于贝那普利或QGYS治疗组，模型组给予相同剂量的清洁水。在实验期间每2周对老鼠的体质量称重并记录，在为期8周的实验时间结束时摘除肾脏。

1.3 尿液和血液检测

实验大鼠在实验研究的第7、28、42、56天被置于代谢笼收集24 h尿液，在此期间并不改变大鼠的进食和饮水习惯,收集尿液以便检测24 h尿白蛋白排泄和尿NAG等项目。收集的尿液样本(5 ml)是在室温条件下离心机离心5 min收集上清液并储存在-70℃超低温冰箱直到测试。血液(3ml)的获得方法主要是通过在实验研究的第7,28,42岁,56 d眼眶静脉取血的方法,然后血液在室温条件下离心10 min后收集血清并储存在-70℃超低温冰箱中以便测定血清白蛋白(SAL)、血清肌酐(SCr)和血液尿素氮(BUN)。生化指标的检测在自动生化分析仪上进行，而尿液中如β2-microgloulin(β2-MG)和NAG酶等的检测使用酶标法测定。

1.4 肾脏样品制备

大鼠脱颈椎处死亡后立即对两侧肾脏进行移除，并除去肾脏外部的包膜，然后对肾脏称重，进行肾脏/身体(K/B)重量比的测定。肾脏使用冷生理盐水清洗,然后使用滤纸擦干。肾脏皮质小心从肾脏上取出并至少3次使用4℃冷盐水溶液冲洗血液,然后从肾脏组织取出大约50 mg肾皮质组织并在电子天平称重，加入Trizol试剂立即冷冻和储存在-70℃越低温冰箱中以使后续RNA提取。

1.5 免疫组织化学分析

这个过程是应用免疫组织化学中标准的SP染色方法。将肾组织样本在10%中性甲醛中固定，酒精脱水后加入石蜡包埋。按照标准切片(4 μm)制备组织切片。切片放入抗原工作液中，5%～10%正常山羊血清封闭抗原，室温孵育。4℃过夜后滴加适当比例稀释的生物素标记二抗。DAB染色、避光，随时显微镜观察，中性树胶封片，光镜下观察。观察方法：棕色或者棕褐色着色面积作为阳性面积。应用计算机医学病理图像分析系统对肾脏组织切片的免疫组织化学染色的结果进行分析，在200倍光学显微镜下每个组织切片采集10个不重叠视野中的阳性染色面积，然后计算每个视野内染色区域的平均光密度数值，然后将数据汇总，应用SPSS统计分析软件进行分析。

1.6 RT-PCR和免疫印迹分析

总RNA提取自肾脏皮质使用一步法苯酚胍盐异硫氰酸酯，过程使用Trizol试剂盒。总RNA浓度测定吸光度在260 nm分光光度计，RT反应和PCR反应按照文献的相关方法进行[9]。

1.7 免疫印迹分析

免疫印迹方法按照文献提供的方法进行[10]。简而言之,肾脏组织保存在体积为3 ml、浓度为10 μg/L的氯化钾缓冲液(pH值7.7)中。然后应用离心机持续离心15 min。取出上清液并收集蛋白提取物, 2 h在150 V12% SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，1 h在4℃ 100 V转移到硝酸纤维素。在4℃条件下膜被浸没到三硼酸盐水Tween-20(TBST-20)的缓冲液中过夜。然后膜使用TBST-20缓冲液反复清洗并使用辣根过氧化物酶(HRP)耦合的二抗孵化2 h。然后使用增强化学发光工具包进行分析，使用β-tubulin的表达作为内参，使用anti-β-tubulin单克隆抗体(1∶1)及其二抗(山羊抗兔IgG-HRP 1∶5000)。为进行蛋白的定量表达,相对强度使用NIH在官方网站提供的图像软件进行分析。特异性抗血清抗体通过吸收试验进行确定。

2 统计学方法

3 结果

3.1 阿霉素肾病大鼠的行为学表现

在实验过程中，对照组所有的老鼠存活并表现出正常的外表、行为与光滑的毛皮以及体质量增加。相反,其他组的老鼠均表现出进食下降和头发光泽度下降、昏睡和缺乏活动,并有腹泻和体质量下降。

3.2 QGYS对肾身体/重量比、血清白蛋白和血脂的影响

表1显示，模型组与对照组比较，血清白蛋白水均显著下降，且差异早在造模第7天就已经出现。使用贝那普利或QGYS治疗可以部分恢复血清白蛋白水平，特别是56 d效果比较差异有统计学意义(P<0.05)。模型组与对照组血脂水平比较明显升高，应用贝那普利或QGYS治疗可以抑制高血脂水平，在实验的56 d具有明显的统计学意义 (P<0.05)。在实验的56天，模型组与对照组K/B质量比比较可以看出明显不同(3.46±0.19 vs 5.91±0.12)。贝那普利治疗或QGYS可以明显降低这个比率(4.85±0.19 vs 4.31±0.28),这种改变相对模型组组间比较具有统计学意义 (P<0.05)。

表1 各组大鼠血清白蛋白和血脂的情况

3.3 QGYS 对24 h尿白蛋白和NAG酶的影响

图1显示，模型组大鼠与对照组比较24 h尿蛋白定量增加非常明显。贝那普利和QGYS治疗组尿蛋白的水平下降明显。治疗的证据表明，QGYS扭转了尿蛋白增加的趋势，与模型组比较尿蛋白减少超过50%左右，组间比较差异有统计学意义(P<0.05)。

图2显示， 对于尿NAG酶而言，模型组大鼠与对照组比较其在42 d和56 d的增加非常明显(P<0.05)。使用贝那普利和QGYS的治疗组后的大鼠NAG水平下降明显出现在实验的42和56 d(P<0.05)。

图1 各组大鼠24 h尿蛋白变化趋势

图2 各组大鼠尿NAG酶变化趋势

3.4 QGYS对肾功能影响

治疗前后各组大鼠肾功能如肌酐和尿素氮未见明显变化，组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。

3.5 QGYS对胶原Ⅳ和FN表达的影响

表2显示，模型组肾小球中FN和胶原Ⅳ的表达明显高于其他组(P<0.05)。应用贝那普利治疗或QGYS治疗后，模型组可以明显减少肾小球胶原Ⅳ和FN的表达水平(P<0.05)。且QGYS与贝那普利治疗结果比较在减少胶原Ⅳ和FN的表达上差异有统计学意义 (P<0.05)。

表2各组大鼠胶原和纤维连接蛋白在肾皮质的表达情况

组别例数CoⅣFN对照组80.133±0.0270.164±0.013模型组80.407±0.070*0.466±0.037*贝那普利组80.243±0.018△0.249±0.027△加味当归补血汤组80.196±0.033△▲0.207±0.012△▲

注：与对照组比较：*P<0.05;与模型组比较：△P<0.05；与贝那普利组比较：▲P<0.05

3.6 QGYS在肾皮质对MMP- 9,TIMP-1和TGF-β1影响

表3图3显示，模型组与空白对照组比较TIMP-1 mRNA和TGF-β1 mRNA的表达在肾皮质明显增加，而MMP-9 mRNA表达明显降低 (P<0.05)。在观察贝那普利和QGYS组与模型组比较,明显降低TIMP-1 mRNA和TGF-β1 mRNA的水平并增加MMP-9 mRNA水平 (P<0.05),且治疗效果组间比较QGYS组比贝那普利组更明显(P<0.05)。

4 讨论

QGYS由当归、黄芪和川芎在一定比例配比下制作而成。课题组从2002年开始应用中药方剂的肾脏病变防治研究，在近年来的基础和临床研究的基础上发现该方剂在慢性肾脏病治疗上有确切疗效，逐渐形成具有自主知识产权的中药方剂并获得国家发明专利证书[8～11]。

表3各组大鼠TIMP-1mRNA,MMP-9mRNAandTGF-β1mRNA在肾皮质的表达情况

组别例数TIMP-1/β-actionMMP-9/β-actionTGF-β1/β-action对照组80.1736±0.05210.064±0.0190.1810±0.0643模型组80.8654±0.3629*0.010±0.002*0.8167±0.3084*贝那普利组80.1993±0.0931△0.046±0.016△0.2032±0.0602△加味当归补血汤组80.3322±0.0953△▲0.020±0.007△▲0.3424±0.0595△▲

注：与对照组比较:*P<0.05;与模型组比较:△P<0.05;与贝那普利组比较:▲P<0.05

图3 各组大鼠在实验56 d时TIMP-1、MMP-9 and TGF-β1表达的情况(RT-PCR和Wester-blot)

肾小球硬化症和/或肾间质纤维化是大多数慢性肾脏疾病的病理学表现。阿霉素肾病大鼠具有相似的病理学特征，阿霉素引起肾病综合征与蛋白尿。其肾脏的病理改变与文献报道的诺霉素或嘌呤霉素及其相似[14],病理改变包括增加肾小球毛细血管通透性[15]。蛋白尿的出现既是一个病变发生的重要标志,也是导致肾脏疾病发生发展的重要影响因素，减少尿蛋白排泄与延缓肾功能下降之间密切相关。众所周知,蛋白尿是引起慢性肾脏病患者肾功能下降的一个独立危险因素。控制尿蛋白的治疗,尤其是使用血管紧张素转换酶抑制剂(AECI)或血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂(ARB)一直被认为是帮助肾脏保护的重要环节[14]。而尿NAG是肾小管损害的重要标志,是用来检测早期或近端肾小管微小损伤的标志物[15]。

ECM在肾脏的集聚肾脏超微结构的一个标志，它和肾功能下降直接相关[16]。TGF-β1被认为是在组织纤维化相关疾病发生的一个关键的分子[17～19]。TGF-β1的其中一个重要影响就是通过刺激间质细胞产生各种胶原和ECM蛋白。TGF-β1也降低了金属蛋白酶的表达并使基质金属蛋白酶组织抑制剂的产生和活性增加。这些作用使成纤维细胞保持和维护其在持续激活状态的自分泌机制,导致进一步的生产TGF-β1[20]。

基质金属蛋白酶(MMPS)在肾脏的主要作用是促进基质蛋白的降解，其活动受到基质金属蛋白酶组织抑制剂(TIMPs)的调控。MMP-9是基质金属蛋白酶家族的一员,具有降解胶原IV、V和VI、FN、层黏连蛋白和其他细胞外基质的作用[21]。TIMP-1是肾脏MMP-9的特定抑制剂。生理条件下,MMPs和TIMPs维持一个动态平衡调控ECM的合成和降解。最近的研究表明,MMPs和TIMPs参与许多肾脏疾病[22,23]。然而结果还有争议，且对于阿霉素肾病而言MMPs和TIMPs的相关研究很少。

在我们的研究中,阿霉素肾病大鼠的尿蛋白和NAG酶随着时间延长增加明显。QGYS具有降低尿蛋白和尿NAG的作用，而且在8周治疗结束时可以减少超过50%的尿蛋白排泄量。治疗效果与西药在大鼠肾小球损伤模型的疗效比较相似或者更加显著[19]。进一步QGYS与贝那普利相比显示出在减少尿NAG方面更好的功效。研究还表明,类似于贝那普利，QGYS可以减少肾小球胶原Ⅳ和FN在肾小球的聚集。本研究结果表明,早期应用QGYS可以有效保护肾功能，且肾功能的保护作用与减少ECM积聚相关。

我们的研究证明，在阿霉素肾病大鼠肾皮质TIMP-1的表达增加和MMP-9的表达降低进而增加TIMP-1/MMP-9的比例使基质的降解减少从而导致ECM的聚集。血管紧张素转换酶抑制剂贝那普利能够减少蛋白尿,减少纤维细胞增殖的作用。肾保护作用与维护MMPs和TIMPs在肾脏表达水平的动态平衡有关,其直接影响ECM在肾脏的聚集[21]。我们结合前期研究基础提出假说，认为QGYS治疗慢性肾脏病的重要作用机制在于减少尿蛋白和肾小球ECM积聚从而治疗肾脏病。研究表明,QGYS调节MMP-9 和TIMP-1的表达水平从而改变了TIMP-1/MMP-9的比例,同时减少TGF-β1在阿霉素肾病大鼠肾皮质的表达。这些发现证实了假说并发现QGYS在阿霉素肾病模型中治疗肾脏病的分子生物学机制。

总之,这项研究表明,QGYS是治疗阿霉素肾病大鼠有效的药物。其疗效机制与抑制肾脏ECM积累和改变TGF-β1,TIMP-1和MMP- 9在肾脏皮质的表达从而有利于降解细胞外基质有关。这些结果表明,QGYS可能是一个有前途的预防和治疗肾纤维化的中药方剂。

[1] Gabbiani G. The biology of the myofibroblast[J]. Kidney Int, 1992,41:530-532.

[2] Muchaneta-Kubara EC, el Nahas AM. Myofibroblast phenotypes expression in experimental renal scarring[J]. Nephrol Dial Transplant, 1997,12:905-915.

[3] Jerums G, Panagiotopoulos S, Tsalamandris C, et al. Why is proteinuria such an important risk factor for progression in clinical trial[J]? Kidney Int, 1997,52:S87-S92.

[4] Rysz J, Pedzik A, Markuszewski L, et al. The role of metalloproteinases in kidney pathophysiology[J]. Pol Merkur Lekarski (Polish), 2005,19:812-815.

[5] Ahmed AK, Haylor JL, El Nahas AM, et al. Localization of matrix metalloproteinases and their inhibitors in experimental progressive kidney scarring[J]. Kidney Int, 2007,71:755-763.

[6] Beaudeux JL, Giral P, Bruckert E, et al. Matrix metalloproteinases, inflammation and atherosclerosis: therapeutic perspectives[J]. Clin Chem Lab Med, 2004,42:121-131.

[7] Liu S, Li Y, Zhao H, et al. Increase in extracellular cross-linking by tissue transglutaminase and reduction in expression of MMP-9 contribute differentially to focal segmental glomerulosclerosis in rats[J]. Mol Cell Biochem, 2006,284:9-17.

[8] 魏明刚，张玲,邵家德,等. 加味当归补血汤对阿霉素肾病大鼠治疗作用的实验研究[J]．中华中医药杂志，2011，26(5)：157-162.

[9] 魏明刚，张玲，倪莉，等． 加味当归补血汤对阿霉素肾病大鼠肾脏足细胞保护机制的实验研究[J]．中国中西医结合杂志,2012,32(8)：1077-1082.

[10] Wei MG, Xiong PH, Zhang L, et al. Effect of Chinese herbs on immunoglobulin A nephropathy: a randomized controlled trial[J]． Journal of tradition chinese medicine, 2013,15, 33(1): 65-69.

[11] 魏明刚． 肾脏病病机的理论探讨[J]． 中国中医基础医学杂志, 2011，17(11)：1188-1191.

[12] Bertani T, Poggi A, Pozzoni R, et al. Adriamycin-induced nephrotic syndrome in rats: sequence of pathologic events[J]. Lab Invest, 1982,46(1):16-23.

[13] Saad SY, Najjar TA, Al-Rikabi AC. The preventive role of deferoxamine against acute doxorubicin-induced cardiac, renal and hepatic toxicity in rats[J]. Pharmacol Res, 2001,43,211-218.

[14] Abbate M, Zoja C, Remuzzi G. How does proteinuria cause progressive renal damage[J]? J Am Soc Nephrol, 2006,17:2974-2984.

[15] Dance N, Price RG, Cattell WR, et al. The excretion of N-acetyl-beta-glucosaminidase and beta-galactosidase by patients with renal disease[J]. Clin Chim Acta, 1970,27:87-92.

[16] Oseto S, Moriyama T, Kawada N, et al. Therapeutic effect of all-transretinoic acid on rats with anti-GBM antibody glomerulonephritis[J]. Kidney Int, 2003,64:1241-1252.

[17] Border WA, Noble NA. Transforming growth factor beta in tissue fibrosis[J]. N Engl J Med, 1994,331:1286-1292.

[18] Varga J, Rosenbloom J, Jimenez SA. Transforming growth factor beta (TGF beta) causes a persistent increase in steady-state amounts of type I and type III collagen and fibronectin mRNAs in normal human dermal fibroblasts[J]. Biochem J, 1987,247:597-604.

[19] McAnulty RJ, Campa JS, Cambrey AD, et al. The effect of transforming growth factor beta on rates of procollagen synthesis and degradationinvitro[J]． Biochim Biophys Acta, 1991,1091:231-235.

[20] Van Obberghen-Schilling E, Roche NS, Flanders KC, et al. Transforming growth factor beta 1 positively regulates its own expression in normal and transformed cells[J]. J Biol Chem, 1988,263:7741-7746.

[21] Fu XY, Park WC, Heineche JW. Activation and silencing of matrix metalloproteinases[J]. Semin Cell Dev Biol, 2008,19:2-13.

[22] Wagner J, Dechow C, Morath C, et al. Retinoic acid reduces glomerular injury in a rat model of glomerular damage[J]. J Am Soc Nephrol, 2000,11:1479-1487.

[23] Sun SZ, Wang Y, Li Q, et al. Effects of benazepril on renal function and kidney expression of matrix metalloproteinase-2 and tissue inhibitor of metalloproteinase-2 in diabetic rats[J]. Chin Med J (Engl), 2006,119:814-821.