益肾化浊解毒法对D-半乳糖致痴呆小鼠学习记忆及氧化应激的影响*

马 涛，徐世军，张允岭△，王永炎

(1.北京中医药大学东方医院，北京 100078； 2.成都中医药大学，成都 611137； 3.中国中医科学院，北京 100700)

AD(Alzheimer’s disease)是老年期痴呆中最重要的形式，目前全球罹患老年痴呆患者达3500万[1]。AD发病隐匿，进程缓慢，早期往往因未得到有效治疗而使该病加重。AD患者后期语言能力丧失、人格变性，给家庭和社会带来沉重负担。由于AD病程不可逆转，后期几无治愈可能，因此针对AD早期进行干预具有重要意义。大量现代研究表明，与线粒体损伤相关的氧化损伤是AD发病早期的重要病理事件[2]。中医认为，老年痴呆(AD)的病机是肾精亏虚、髓海不足、津液膏脂聚为痰浊，血行涩滞，痰瘀阻络，络病神伤[3]。

王永炎院士针对AD肾虚浊毒、损伤脑络病机，运用益肾化浊解毒法治疗AD，采用复方苁蓉益智胶囊(FFCR)滋肾阴、化浊毒，补虚泄实，标本兼治。本研究以D-半乳糖致痴呆小鼠为对象，研究益肾化浊法对亚急性衰老致痴呆小鼠学习记忆及脑内氧化应激的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物

BALB/c雄性小鼠72只(3月龄)，体质量(20±2) g，SPF级，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供(合格证号SCXK(京)2009-0007)。

1.2 药物与试剂

D-半乳糖购自Sigma-Aldrich公司，复方苁蓉益智胶囊(FFCR)由辽源誉隆亚东药业有限责任公司生产(国药准字Z20080047，生产批号1005070002)。阳性对照药：安理申，卫材(中国)药业有限公司生产(国药准字H20050978，生产批号120414A)。RIPA组织裂解液(批号20110315)、BCA蛋白测定试剂盒(批号20110205)购自普利莱基因技术有限公司，超氧化物歧化酶(SOD)测定试剂盒(批号20110316)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)测定试剂盒)(批号20110313)、丙二醛(MDA)测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所(批号20110313)，8-羟基-2’-脱氧鸟苷(8-OHdG)抗体(J-1)(货号sc-139586)购自Santa Cruz公司，其他化学试剂均为国产分析纯。

1.3 仪器

SBA-2小鼠避暗程序自动控制仪(中国医学科学院药物研究所)，5810R台式多功能高速冷冻离心机(Eppendorf公司)，UV3300 紫外可见分光光度计(上海美谱达公司)，FLX800酶标仪(Biotex公司)。

1.4 动物分组及造模

3月龄雄性BALB/c小鼠72只，按随机数字表法分为正常对照组、模型组、安理申(阳性药)组、FFCR高、中、低剂量组6组，每组12只。以正常小鼠为对照组，模型小鼠每天颈背皮下注射D-半乳糖 0.1 g/kg BW，连续注射50 d。

1.5 动物给药

FFCR采用无菌水配制成0.08 g/mL、0.04 g/mL和0.02 g/mL混合液。安理申无菌水配制成0.1 mg/mL溶液。FFCR各组在模型组基础上同时每天分别灌服1.2 g/kg BW、0.6 g/kg BW和0.3 g/kg BW的FFCR，阳性药(安理申)组每天灌服1 mg/kg BW，正常组和模型组灌服同体积生理盐水，连续灌胃50 d。

1.6 小鼠避暗实验

小鼠给药结束后进行避暗实验。小鼠避暗反射箱分单独5个箱，分为明暗两室。反射箱通过数据线与电脑相连，由电脑控制。实验时将小鼠头部背对洞口放入明室，小鼠一进入暗室立即受到电击，记录小鼠放入明室至受到第一次电击的时间(即潜伏期)和5 min内进入暗室的错误次数，此为训练成绩。24 h后重复测定，为测试成绩。

1.7 免疫组织化学染色

行为学测试结束后，选择6只小鼠4%多聚甲醛灌注固定，取全脑放入4%多聚甲醛过夜，常规制备石蜡切片。小鼠脑组织石蜡切片精二甲苯脱蜡，0.01 mol/L PBS冲洗，微煮沸修复抗原，自然冷却，PBS冲洗。5%山羊血清室温孵育1 h，一抗(兔抗小鼠8-OhdG多克隆抗体)4℃湿盒孵育过夜。生物素标记山羊抗兔IgG(1∶200)室温孵育2 h，0.05 mol/L Tris-Cl 充分漂洗，链霉素抗生物素蛋白-过氧化氢酶室温孵育1 h，DAB显色10 min，蒸馏水冲洗，常规脱水、透明、封片，光学显微镜(20倍物镜)观察形态学变化并采集图像。

1.8 小鼠脑内SOD、GSH-PX活性及MDA含量测定

行为学测试后，6只小鼠脱颈处死。取全脑称重后，加入RIPA裂解液，采用玻璃匀浆器在冰上匀浆，4℃10000 rpm离心取上清。BCA法测定蛋白浓度。按试剂盒说明测定脑组织SOD、GSH-PX活性及MDA含量。

1.9 统计学方法

2 结果

2.1 复方苁蓉益智胶囊对D-半乳糖致痴呆小鼠学习记忆能力的影响

表1显示，模型小鼠给药50 d后，避暗实验结果显示，与正常对照组比较，模型组小鼠进入暗箱的潜伏期明显缩短(P<0.01)，而错误次数则显著增加(P<0.05)，表明D-半乳糖对小鼠学习记忆能力产生了明显的损伤。与模型组比较，FFCR各组可显著增加进入暗箱的潜伏期(P<0.05)，减少进入暗箱的错误次数(P<0.05)，并呈剂量依赖关系。其中高剂量FFCR可使模型小鼠避暗实验潜伏期增加352.20%，错误次数减少60.14%。FFCR各组可显著减少小鼠进入暗室的错误次数(P<0.05)。结果表明，FFCR可显著改善D-半乳糖对小鼠脑学习记忆功能损伤，且总体改善效果优于阳性对照药安理申。

表1 复方苁蓉益智胶囊对D-半乳糖致痴呆小鼠避暗实验潜伏期和错误次数的影响

注：与正常对照组比较：ΔP<0.05，ΔΔP<0.01；与模型组比较：*P<0.05

2.2 复方苁蓉益智胶囊对D-半乳糖致痴呆小鼠脑内8-羟基-2’-脱氧鸟苷(8-OHdG)表达的影响

图1显示，与正常对照组比较，模型组小鼠皮层神经细胞胞浆中8-OhdG表达显著增高，表明D-半乳糖损伤神经细胞线粒体。与模型组比较，高剂量FFCR可明显减少模型小鼠大脑皮层8-OhdG表达，而安理申则对8-OhdG表达无显著影响。

图1 复方苁蓉益智胶囊对D-半乳糖致痴呆小鼠脑组织8-羟基-2’-脱氧鸟苷表达的影响(×200)A正常对照组；B模型组；C阳性药组；D复方苁蓉益智胶囊高剂量组(标尺长度为200 μm)

2.3 复方苁蓉益智胶囊对D-半乳糖致痴呆小鼠脑组织SOD活性的影响

表2显示，与正常对照组比较，模型组小鼠脑组织SOD活性显著降低(P<0.01)。与模型组比较，FFCR各组可显著提高模型小鼠脑内SOD活性(P<0.05)，并呈剂量依赖关系。其中高剂量FFCR可使模型小鼠SOD水平提高59.87%，说明FFCR可有效清除超氧阴离子，保护脑组织免受氧化损伤。

表2 复方苁蓉益智胶囊对D-半乳糖致痴呆小鼠脑组织SOD活性的影响

注：与正常对照组比较：ΔΔP<0.01；与模型组比较:*P<0.05

2.4 复方苁蓉益智胶囊对D-半乳糖致痴呆小鼠脑组织GSH-PX活性的影响

表3显示，与正常对照组比较，模型组小鼠脑内GSH-PX活性显著降低(P<0.01)。与模型组比较，FFCR各剂量组以剂量依赖方式显著提高GSH-PX活性(P<0.01或P<0.05)，其中高剂量FFCR可使模型小鼠GSH-PX水平提高78.81%，说明FFCR可显著提高D-半乳糖致痴呆小鼠脑组织抗氧化能力，而阳性药(安理申)对GSH-PX的影响不显著。

2.5 复方苁蓉益智胶囊对D-半乳糖致痴呆小鼠脑组织MDA水平的影响

表4显示，与正常对照组比较，模型小鼠脑组织内MDA水平显著增高(P<0.01)，表明脂质过氧化损伤参与了D-半乳糖对脑组织的损伤损伤过程。与模型组比较，FFCR各组均可显著降低MDA水平(P<0.01或P<0.05)，其中高剂量FFCR可使模型小鼠脑内MDA水平降低31.89%，表明FFCR可有效阻止D-半乳糖致痴呆小鼠脑内的脂质过氧化损伤，而阳性药(安理申)对模型小鼠脑内MDA水平影响不显著。

表3 复方苁蓉益智胶囊对D-半乳糖致痴呆小鼠脑组织GSH-PX活性的影响

注：与正常对照组比较：ΔΔP<0.01；与模型组比较:*P<0.05，**P<0.01

表4 复方苁蓉益智胶囊对D-半乳糖致痴呆小鼠脑组织MDA水平的影响

注：与正常对照组比较：ΔΔP<0.01；与模型组比较:*P<0.05，**P<0.01

3 讨论

机体衰老后往往出现肾精亏虚、髓海不足和脑髓失养。AD的基本病机是肾虚浊毒、损伤脑络，其中肾虚是AD发病的重要病理基础，而痰浊则是推动AD发展的重要因素[4]。针对AD“肾虚痰浊阻窍”病机，临床上采用益肾化浊解毒法治疗该病。复方苁蓉益智胶囊由制首乌、荷叶、肉苁蓉、地龙、漏芦组成。方中制首乌、肉苁蓉共为君药，滋肾阴，益精血；荷叶升阳利湿，地龙清热通络，两者相配使清阳以升、浊阴得降；漏芦清热解毒，共奏补肾益髓、活血化浊、解毒通络之功。

AD是一种复杂的神经退行性病变，有多种因素参与其病理过程，衰老是AD公认的危险致病因素。现代大量研究表明，以氧化损伤为核心的病理改变在AD病程恶化过程中发挥了重要作用。许多研究表明，在AD患者出现神经损伤的极早期，易感神经元即出现氧化损伤[5]，说明氧化损伤是AD发病早期的重要病理因素。在AD发病过程中，由于体内氧化还原平衡受到破坏，机体内抗氧化酶类包括SOD、GSH-PX活性下降，导致氧自由基大量释放，产生氧化应激，造成脂质过氧化、线粒体损伤等，进而损伤神经细胞，影响记忆功能[6]。

本实验从氧化损伤的角度研究益肾化浊解毒方药复方苁蓉益智胶囊对D-半乳糖致痴呆小鼠学习记忆能力和氧化损伤的影响，以此探究益肾化浊解毒与抗氧化之间的联系。本实验结果显示，复方苁蓉益智胶囊可以剂量依赖的方式显著提高D-半乳糖诱导的亚急性衰老致痴呆小鼠脑内抗氧化酶类的活性，提高机体抗氧化能力，减少氧化损伤，提高记忆能力，提示益肾化浊解毒法可通过提高机体抗氧化能力，保护线粒体功能，发挥治疗作用。

[1] Alzheimer’s Disease International[M]. World Alzheimer Report， 2012.

[2] Cervellati C, Romani A, Seripa D, et al. Oxidative balance, homocysteine, and uric acid levels in older patients with Late Onset Alzheimer’s Disease or Vascular Dementia[J]. J Neurol Sci， 2014,337(1-2):156-161.

[3] 王月芳，万海同. 论肾虚痰凝血瘀是老年痴呆的重要发病机理[J].中国中医基础医学杂志，1999,5(8):9-12.

[4] 张艳霞, 张允岭. 基于现代文献的老年性痴呆证型及证候要素分布研究[J]. 北京中医药大学学报, 2011,34(6):417-420.

[5] Nunonura A, Perry G, Aliev G, et al. Oxidative damage is the earliest event in Alzhimer disease. J Neuropathol[J]. Exp Neurol， 2001,60(8):759-767.

[6] Aliev G, Priyadarshini M, Reddy VP, et al. Oxidative stress mediated mitochondrial and vascular lesions as markers in the pathogenesis of Alzheimer disease[J]. Curr Med Chem， 2013[Epub ahead of print].