整合素连接激酶在梗阻性肾病合并肾小管酸中毒中的表达

陈琇萌，俞小敏，张惠丽

(广州医科大学附属第一医院肾内科 510120)

梗阻性肾病可导致肾小管间质纤维化，慢性肾衰竭的进展与肾小管间质损害和纤维化关系密切。梗阻性肾病常合并肾小管酸中毒，肾小管酸中毒不但加剧肾结石的形成、导致内环境紊乱，而且进一步加重肾小管间质损害和纤维化，加速肾功能衰竭。本研究通过观察单侧输尿管梗阻(UOO)合并肾小管酸中毒的小鼠模型整合素连接激酶(ILK)的表达，了解肾小管间质纤维化的启动机制及加重因素，探讨肾小管酸中毒在梗阻性肾病中诱导肾小管间质纤维化的作用机制。

1 材料与方法

1.1试剂 Western blot和免疫组织化学法的MMP-9抗体和ILK抗体购自美国Santa Cruz公司，免疫组织化学二抗(小鼠抗兔)购自美国Dako公司，免疫发光二抗(山羊抗兔)购自美国Cell Signaling 公司。

1.2方法

1.2.1动物模型的建立与分组 实验大鼠由广州医科大学动物中心提供，75只清洁级成年雄性大鼠，8～10周龄，体质量150～220 g，分为假手术组(对照，n=25)和UUO组大鼠(n=50)。建立UUO组模型[1](3%水合氯醛腹腔麻醉30 mL/kg)。假手术组除不结扎输尿管外，其余步骤与UUO组相同。检测小鼠血、尿钾和pH值、尿液中可滴定酸和铵离子、尿二氧化碳分压(PCO2)/血PCO2值，于术后第7天筛选出肾小管酸中毒组(UUO1组,n=31)和非肾小管酸中毒组(UUO2组,n=19)，分4个时期(7、14、21、28 d)处死各组大鼠，取左侧部分肾组织置于10%甲醛中，并予石蜡包埋；其余肾组织液氮冰冻，置于-80 ℃保存。

1.2.2血、尿生化检测 采用生化法检测血、尿钾和pH值、尿液中可滴定酸和铵离子、尿PCO2/血PCO2值。

1.2.3肾组织病理学检查 石蜡组织切片作HE、PAS和Masson染色。采用百分比评分法评估肾小管损伤程度，计算30个高倍视野(×400)肾皮质中出现损害(肾小管扩张、管型、坏死或小管炎、萎缩)的肾小管数目及总肾小管数，以损害的肾小管数占总肾小管数的百分比表示。

1.2.4Western blot法检测肾组织ILK、纤粘连(FN)蛋白的表达水平 (1)蛋白质抽提、聚丙烯胺凝胶电泳及转膜。(2)硝酸纤维素(NC)膜置于50 g/L牛奶-TBS溶液中室温封闭1 h，加入1∶2 000抗大鼠一抗，室温孵育1 h，1 g/L TBS-Tween溶液洗涤3次，再加入1∶2 000 HRP-conjugated二抗，室温孵育1 h，1 g/L TBS-Tween溶液洗涤3次，TBS溶液洗涤5 min，Lumi-GLO室温孵育1 min，暗房中冲洗胶片。(3)半定量方法分析肾组织中ILK、FN蛋白表达水平。

2 结 果

2.1光镜下肾脏病理改变 与假手术组相比，UUO2组术后7 d肾间质炎症加重，集合管、肾小管水肿、扩张；14、21 d肾小管基底膜开始增厚、上皮细胞肿胀、变性，后期肾间质出现纤维化改变；28 d时质内有大量肌成纤维增生和纤维结缔组织形成，肾小管全程扩张，上皮细胞萎缩。UUO1组在各期病较UUO2组炎症细胞浸润和间质纤维化加重，28 d时基本无正常结构的肾小球。

2.2大鼠肾组织ILK与FN蛋白的表达 UUO2组大鼠肾组织中可检测到FN蛋白的沉积和ILK的表达，UUO1大鼠肾组织FN蛋白的沉积和ILK的表达高于UUO2组。假手术组仅有少量的ILK蛋白表达，几乎无FN蛋白的沉积，UUO2组ILK蛋白表达及FN蛋白的沉积增多，而UUO1组较UUO2组增多。UUO1、UUO2两组差异有统计学意义(P<0．01)，见图1。相关性分析结果表明，肾组织中ILK的表达水平与FN蛋白沉积的程度呈正相关。

1:28 d对照组；2～5：7、14、21、28 d UUO1组；6～9：7、14、21、28 d UUO2组。

图1大鼠肾组织ILK和FN蛋白的表达情况

3 讨 论

梗阻性肾病可致肾小管尤其是其远端的管腔负电位无法维持(电压依赖型)，使泌氢入管腔的速率减慢，导致非分泌缺陷性酸化功能障碍，即远端肾小管酸中毒。临床表现为尿中可滴定酸和铵离子减少、尿pH上升(>6.0)、血pH下降(正常阴离子间隙的高氯性代谢性酸中毒)、低钾血症及钙磷代谢障碍等。肾小管酸中毒不仅造成内环境的紊乱、泌尿系结石形成，更可能造成肾小管受损，最终导致肾间质-小管纤维化。肾小管间质纤维化是梗阻性肾病进展为终末期肾衰竭的最终路径之一。

在慢性肾衰竭肾间质纤维化过程中，会产生多种细胞因子、生长因子及血管活性物质。上皮细胞向肌成纤维细胞的转分化是参与肾小管间质纤维化的重要机制之一[2]。转分化受多种细胞因子、生长因子和激素的调节，值得强调的是，TGF-β1诱导转分化的过程是在病理状态下导致肾间质纤维化的主要途径。而目前研究认为，梗阻性肾病时局部和系统产生的细胞因子和血管活性物质激活细胞，使浸润的单核巨噬细胞及转分化的细胞分泌细胞外基质显著增多。其中构成细胞外基质的重要组成FN蛋白在间质中大量聚积是导致肾小管间质纤维化的病理基础[3]。TGF-β1具有多种生物学功能，其中以在组织器官免疫以及非免疫损伤后瘢痕和纤维化形成过程中的作用最令人关注，是迄今为止发现的在纤维和结缔组织基质发生过程中最为主要的细胞因子。TGF-β1的高表达在肾脏纤维化的形成中的作用已明确，TGF-β1族细胞因子通过不同信号传导途径产生多种生物效应，其中Smads家族蛋白是其细胞内信号传导通路中的重要因子[4]。参与TGF2/Smad这一信号传导途径的Smads家族蛋白主要有Smad2、3、4、7。Snail抑制E-钙黏蛋白破坏上皮细胞极性,将上皮细胞转换成间充质细胞；Snail上调基质金属蛋白酶的表达破坏小管基底膜；国外学者认为Snail和LEF-1转录抑制的相互作用是TGF2-β1诱导的上皮细胞间质转化的必须因素。而ILK是其信号传导途径的效应分子，介导了TGF2-β1诱导肾小管转分化的各个关键步骤。

Li等[5]提出TGF-β1-Smad-ILK-EMT轴的存在，ILK在TGF-β诱导的EMT可能起关键作用。ILK能够调节FN蛋白的组装与沉积，即促使细胞产生的分泌型FN转分化组装成不溶的FN而直接沉积于细胞间隙，以此参与细胞外基质的聚积[6]。ILK是1996年Hannigan以β1整合素胞质域为诱饵，应用酵母双杂交系统发现的一种具有多种功能的丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶，ILK能通过与整合素β1亚单位胞内域相互作用，介导细胞与细胞外基质(如FN蛋白)的连接[7-8]。Li等[9]发现细胞与基质积聚的相互作用是由ILK介导完成，与肾脏病变程度相关。ILK能够直接参与细胞形态学的改变以及细胞的生长、分化和基因表达。在肾间质纤维化过程中，ILK是诱导转分化的关键调节因子，可能参与肾小管上皮细胞-肌成纤维细胞转分化的关键步骤。有研究表明，在正常肾间质中无或仅有极少量ILK表达，随肾间质病变程度的加重，ILK表达量明显增加，肾小管上皮细胞病变越重表达越强，萎缩变性的肾小管表达最为强烈[10]。

本研究通过动物实验发现，合并肾小管酸中毒的UUO大鼠较未合并肾小管酸中毒的UUO大鼠肾组织ILK蛋白的表达与FN蛋白的沉积上升。因此认为梗阻性肾病合并肾小管酸中毒，加速了肾小管间质纤维化，与ILK的高表达及FN蛋白的沉积相关。本研究探讨的肾小管酸中毒通过上调ILK介导梗阻性肾病FN蛋白沉积的成因，不仅有利于认识梗阻性肾病合并肾小管酸中毒导致肾小管间质纤维化的启动机制及加重因素，而且有助于在此基础上发展防治梗阻性肾病的新措施。

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