超临界CO2萃取茶叶籽油及其分子蒸馏馏出物抗氧化成分分析

董海胜，臧 鹏，陈 斌，朱德兵，张淑静

(中国航天员科研训练中心航天营养与食品工程重点实验室，北京， 100094)

我国是世界主要的产茶国，茶树种植面积广泛，茶叶籽为山茶科植物茶叶树(CamelliasinensisL.)的种子，资源非常丰富。笔者前期研究发现脱壳茶叶籽主要组成为淀粉、蛋白质及脂肪，矿物元素钾、钙及镁含量较高，钠含量相对较低，微量元素锰、铁、锌含量丰富。茶叶籽油提取自茶叶籽，是一种功能性木本油脂新资源。茶叶籽油脂肪酸组成特点为高油酸、亚油酸含量，不饱和脂肪酸含量超过80%。茶叶籽油具有天然的抗氧化活性，富含生育酚，以生物活性最高的α-生育酚为主，其次为(β+γ)-生育酚和δ-生育酚[1,2]。

由于超临界CO2萃取具有高纯度萃取、无残留溶剂、无环境污染、萃取条件温和等优势，在高附加值油脂萃取方面有着广泛的应用，如黑醋栗籽油、琉璃苣籽油、夜樱草油、亚麻籽油、紫苏籽油、芝麻油及沙棘油等[3～7]。据报道，茶叶籽毛油具有很好的抗氧化性，而经过精炼后的成品油需要加入抗氧化剂[8,9]。如何保留茶叶籽油中的抗氧化物质成为茶叶籽油提取及精炼的关键问题。近年来，超临界萃取在茶叶籽油的利用研究也逐渐展开[10,11]。分子蒸馏又名短程蒸馏是一种物理过程，在高真空条件下操作(绝对压强2～10 Pa)，可以有效的避免抗氧化成分的氧化变质，根据分子量的差异，利用不同分子具有不同的平均自由程而达到分离的方法，在脂溶性抗氧化成分分离纯化领域得到了较广泛的应用。笔者采用超临界二氧化碳选择性萃取茶叶籽油，进而用分子蒸馏技术处理茶叶籽油，得到馏出物，采用UHPLC-TOF-MS分析馏出物中极性抗氧化成分。

1 材料与方法

1.1 仪器与材料

HA121-50-02型超临界流体萃取装置，南通华安石油仪器科研有限公司生产；瓶装食品级CO2，体积分数0.999(纯度99.9%)，北京普莱克斯气体有限公司生产；2英寸刮膜式分子蒸馏系统，美国POPE科学公司生产，配置冷却水循环系统及石墨刮板；Agilent 1290 UHPLC/6540QTOF MS，安捷伦科技公司生产；JJ1000电子天平，常熟仪器设备有限公司生产。茶叶籽，采自南方茶园。

1.2 超临界流体CO2选择性萃取茶叶籽油

脱壳茶叶籽，粉碎，过筛，取样品约450 g，装入萃取釜。采用超临界流体萃取系统基本流程，储罐中的液态CO2经高压泵泵入萃取釜，在萃取釜内变为超临界CO2，进行溶质萃取物质交换，载有茶叶籽油溶质的超临界CO2进入分离釜Ⅰ，在分离釜Ⅰ中CO2变为气态，溶解能力降低，溶质被分离出来，气态CO2经过净化，重新返回储罐，如此循环萃取操作，从分离釜中取样收集萃取样品。

1.3 茶叶籽油分子蒸馏处理

根据预试验结果设置分子蒸馏操作参数，具体数值见表1。料温为室温，为维持真空度稳定，预先应用分子蒸馏装置在100 ℃，真空度大约20 Pa的条件下对原料进行脱气。分子蒸馏装置见图2。由于甘油三酯分子量与抗氧化成分相比较大，因此，抗氧化成分主要集中在馏出物中。

图1 超临界CO2选择性萃取茶叶籽油的萃取流程

图2 刮膜式分子蒸馏装置

表1 茶叶籽油分子蒸馏操作参数

表2 色谱分离梯度洗脱程序

1.4 茶叶籽油分子蒸馏馏出物极性抗氧化成分分析

1.4.1样品处理 茶叶籽油馏出物为半凝固膏状物，水浴融化后用V(乙腈)∶V(异丙醇)=1∶1稀释后进样。

1.4.2色谱分离条件 色谱柱：Agilent SB C18, 3.0×100 mm，1.8 μm；流速：0.4 mL/min；柱温：40 ℃。流动相：A，乙腈；B，水。梯度洗脱程序见表2。

1.4.3质谱工作条件 离子源：AJS+ESI(-)；扫描范围：m/z 100-1100。数据采集过程中，实时进行质量轴校正，以确保分析化合物的质量精度及后续数据库检索的可靠性。利用自建数据库进行检索。检索结果全面考虑精确质量数(检索窗口10 mg/kg)、同位素的精确质量数及同位素的相对丰度比给出综合得分。对茶叶籽油中的抗氧化成分进行初步筛选。

1.5 酸价、过氧化值测定

依据GB/T5009.37-2003食用植物油卫生标准的分析方法[12]。

2 结果与分析

2.1 不同萃取压力对茶叶籽油提取时间及得率的影响

通过萃取釜精密压力调节阀控制萃取压力，同时调节泵频固定CO2流速，观察萃取压力对萃取时间及得率的影响，结果见表3。实验条件：萃取温度35 ℃；分离压力12 MPa，分离温度40 ℃；分离II压力6 MPa，分离温度50 ℃；CO2流体流速7.5 L/h。

表3 萃取压力对茶叶籽油提取时间及得率的影响

萃取压力升高可以缩短提取时间。萃取温度：萃取温度越低CO2密度越大，溶解能力越强，以临界温度以上，35 ℃为宜，且能耗较低。分离Ⅰ压力升高，大于临界压力7.1 MPa，可以将水、部分游离脂肪酸释放在分离Ⅱ。分离Ⅰ温度应高于萃取温度，以形成温度梯度，使溶质分离释放出来，以40 ℃为宜，且能耗较低。分离Ⅱ压力应足够低、使得CO2呈气态，将溶质成分全部释放，CO2经过后续净化再进入循环。分离Ⅱ温度与压力配合，温度高于分离Ⅰ，以50 ℃为宜，且能耗较低。

2.2 不同CO2流速对茶叶籽油提取时间及得率的影响

固定萃取压力25 MPa，萃取温度35 ℃；分离压力12 MPa，分离温度40 ℃；分离Ⅱ压力6 MPa，分离温度50 ℃。通过调节泵频来控制CO2流体流速，观察流速对萃取时间及得率的影响。结果表明， CO2流速对萃取效率影响较大，增加流速可以显著提高萃取效率(表4)。

表4 CO2流速对茶叶籽油提取时间及得率的影响

2.3 茶叶籽油萃取压力与CO2流速的关系

图3 茶叶籽油萃取压力与CO2流速的关系

固定高压泵频率，调节茶叶籽油萃取压力，观察CO2流速随萃取压力的变化情况。结果表明，两者大致呈线性负相关(图3)。在泵性能及泵频一致的情况下，萃取或分离压力提高，相应的CO2流速降低。

2.4 超临界CO2梯度萃取模式下茶叶籽油酸价及过氧化值

超临界CO2梯度萃取模式下,萃取初始阶段所得茶叶籽油酸价较高，过氧化值维持在较低的水平(表5)。采用分段萃取可以在第Ⅱ阶段得到澄清的油脂，但是第Ⅰ阶段的油比较粘稠且不澄清，增加后处理负担。采用低压低温(低密度)萃取得到第Ⅰ阶段的油多数粘稠不澄清，萃取速度较慢，可以实现脱除脂肪酸的目的。进一步升压(提高CO2密度)萃取，单位时间萃取速率加快，且得到的油脂颜色较浅，酸价较低。

采用梯度萃取的模式，游离脂肪酸主要集中在萃取过程的Ⅰ段，酸价较高，说明游离脂肪酸相比甘油三酯更容易萃取溶解在超临界CO2中，萃取过程后段，酸价显著降低，因此，采用梯度萃取的方式可以实现脱酸的目的。由于超临界CO2萃取过程中，油料始终处于惰性CO2氛围中，隔绝了O2，样品过氧化值很低，有利于油品品质。

2.5 茶叶籽油分子蒸馏流出物抗氧化成分分析

茶叶籽油分子蒸馏馏出物的总离子流图TIC见图4。从总离子流图可以看出，样品基质很复杂，对目标化合物的检测会存在一定的离子抑止效应。检索结果得分在70分以上的可能化合物共筛出5种(表6)。

表5 梯度萃取茶叶籽油的酸价、过氧化值

图4 茶叶籽油分子蒸馏馏出物的总离子流图

表6 茶叶籽油分子蒸馏馏出物中主要极性抗氧化成分

儿茶素是茶多酚类物质的主要成分，是茶叶树的主要此生代谢产物，属黄烷醇类，主要在茶叶中富集，包括表没食子儿茶素没食子酸酯、表儿茶素没食子酸酯、表没食子儿茶素和表儿茶素等[13～15]。据报道[16]，石油醚萃取的茶叶籽油中多酚的质量分数为(24.81±1.00) mg/kg。其中，茶叶籽油中儿茶素的质量分数分别为：没食子儿茶素1.01 mg/kg，表没食子儿茶素12.93 mg/kg，表没食子儿茶素没食子酸酯1.724 mg/kg，表儿茶素0.79 mg/kg，没食子儿茶素没食子酸酯1.76 mg/kg，表儿茶素没食子酸酯0.28 mg/kg。本次研究采用超临界CO2从茶叶籽中选择性萃取茶叶籽油，通过分子蒸馏技术处理茶叶籽油，得到馏出物，发现茶叶籽油馏出物中抗氧化成分包括：山茶甙C，表儿茶素没食子酸酯，表阿福豆素，表儿茶素及表没食子儿茶素等5种。其中抗氧化成分山茶甙C[17]，表阿福豆素[18]为首次在茶叶籽油中发现。

3 结论与讨论

本次研究将超临界萃取与分子蒸馏两种技术结合，并采用UHPLC-TOF-MS技术，对茶叶籽油中极性抗氧化成分进行了定性分析。共鉴定得到5种抗氧化成分，分别为：山茶甙C，表儿茶素没食子酸酯，表阿福豆素，表儿茶素及表没食子儿茶素。与茶叶中的抗氧化成分类似，而这些成分在其他植物油中几乎不存在，因此茶叶籽油作为功能性木本油脂具有独特的保健价值。

[1] 董海胜,臧鹏,王妮,等.电感耦合等离子体发射光谱法测定茶叶籽中多种元素[J].食品安全质量检测学报，2014，5(1)：265-270.

[2] 董海胜,陈斌.茶树籽油与马齿苋籽油中脂肪酸及维生素E组成分析与比较[J].营养学报,2012,34(1):94-96.

[3] Ernesto Reverchon,Iolanda De Marco.Supercriticalfluid extraction and fractionation of natural matter[J].J of Supercritical Fluids，2006(38)：146-166.

[4] Yasantha Athukorala,F S Hosseinian,G Mazza.Extraction and fractionation of alkylresorcinols from triticale bran by two-step supercritical carbon dioxide[J].LWT-Food Science and Technology，2010(43)：660-665.

[5] Sontaya Krichnavaruk,Artiwan Shotipruk,Motonobu Goto,et al.Supercritical carbon dioxide extraction of astaxanthin from Haematococcus pluvialis with vegetable oils as co-solvent[J].Bioresource Technology,2008(99)：5 556-5 560.

[6] Ahmad Rajaei,Mohsen Barzegar,Yaddollah Yamini.Supercritical fluid extraction of tea seed oil and its comparison with solvent extraction[J].European Food Research and Technology,2005,3(220)：401-405.

[7] Kar Lin Nyam，Chin Ping Tan，Roselina Karim，et al.Extraction of tocopherol enriched oils from Kalahari melon and roselle seeds by supercritical fluid extraction (SFE-CO2)[J].Food Chemistry，2010，119(3)：1 278-1 283.

[8] Mohammad Ali Sahari,Davood Ataii,Manuchehr Hamedi．Characteristics of tea seed oil in comparison with sunflower and olive oils and its effect as a natural antioxidant[J].JAOCS,2004,6 (81)：585-588.

[9] Ramaswamy．Fat stability and amino acids in south Indian tea seeds[J].International Journal of Food Science & Technology,1993,6(28)：639-646．

[10] 麻成金，黄群，吴道宏，等.超临界CO2和微波萃取茶叶籽油工艺研究[J].食品科学，2008，29(10)：281-285.

[11] 孙冀平，计咏燕，裘爱泳．超临界CO2萃取茶籽油初步研究[J].粮食与油脂，2002(5)：2-4．

[12] 中华人民共和国卫生部，中国国家标准化管理委员会.GB/T 5009-2003食用植物油卫生标准的分析方法[S].北京：中国标准出版社，2003.

[13] 周瑞宝.绿茶多酚化合物的精制和抗氧化试验[J].中国粮油学报，2000，15(2)：37-39.

[14] 刘小乔，李忠岐，高静，等.茶多酚中儿茶素类的HPLC分析[J].光谱实验室，2012，29(5)：2 611-2 615.

[15] Godwin R Roberts.Polar lipid composition of the leaves and seeds from the tea plant (CamelliasinensisL.)[J].Journal of the Science of Food and Agriculture,2006,5(25)：473-475．

[16] Fazel M,Sahari M,Barzegar M.Determination of Main Tea Seed Oil Antioxidants and their Effects on Common Kilka Oil[J].International Food Research Journal，2008，15：209-217.

[17] 张国彬，冯玲玲，周吉源.山茶属植物的研究现状与展望[J].湖北林业科技，2004，11(2):45-49.

[18] Min K R,Hwang B Y,Lim H S,et al.(-)-Epiafzelechin: cyclooxygenase-1 inhibitor and anti-inflammatory agent from aerial parts of Celastrus orbiculatus[J].Planta medica,1999,65(5):460-462.