广东菲牛蛭中有效抗凝物质的分离纯化

卢舒凡 李庆国 许淑芹

水蛭是我国传统中药，早在《神农本草经》中就有记载。同时，水蛭也是一味世界性的动物药，许多国家如埃及、欧洲都有外用活水蛭治病的传统。直到1884年，才由Haycraft发现医蛭提取物具有抗凝活性，拉开了水蛭素应用研究的序幕［1］。目前，我国对水蛭的研究主要侧重水蛭的各种疗效和药理作用，而对有效成分的研究远远滞后于国外，除氨基酸和抗凝活性成分测定外，国内大部分蛭类均未见有效成分的报道。在水蛭研究方面，目前存在的两大问题是物种来源混乱、有效成分不清晰。本研究以广东菲牛蛭(俗称“金边蚂蟥”)为材料，分离纯化其有效抗凝物质，为后续的结构分析、药理药效研究、剂型研制及应用打下基础。

材料与方法

1．仪器:JJ-2组织匀浆捣碎机(江苏金坛环宇科学仪器厂生产)，SHZ-82恒温振荡器(江苏金坛富华仪器有限公司生产)，TGL-16B高速台式离心机(上海安亭科技仪器厂生产)，中低压层析柱(上海楚定生产)，MSC050杯式超滤器(上海摩速有限公司生产)，电泳仪(北京伯乐科学公司生产)。

2．试验药品:广东菲牛蛭(广州水蛭生物科技有限公司生产)，DEAE-Sepharose F．F．(Amersham 公司)，SP-120-40/60-ODS-BP(Daiso公司)，凝血酶，纤维蛋白原，蛋白标准marker(均为Sigma公司生产)，BCA试剂盒(广州美津生物技术公司生产)。

3．凝血酶滴定法［2］:在 37．0 ±0．5℃恒温条件下，吸取样品20μl，置反应板孔中，加入含0．5%牛纤维蛋白原的三羟甲基氨基烷盐缓冲液200μl，混合均匀，恒温5min，滴加每1ml中50单位的凝血酶溶液(每分钟滴加1次，每次5μl，边滴加边搅匀)至凝固，记录消耗凝血酶溶液体积，结果按下式计算:C2=(C1·V1)/V2，式中C1:凝血酶的单位浓度(单位NIH/ml)，V1:消耗凝血酶体积(单位μl)，C2:样品的单位抗凝活性(单位ATU/ml)，V2:样品加入量(单位μl)。

4．广东菲牛蛭中抗凝物质的分离纯化［3，4］:(1)粗提:取广东菲牛蛭冷冻鲜体100g，与5倍量蒸馏水混合，置匀浆搅拌机中，10000r/min破碎完全，4000r/min冷冻离心20min，收集上清液Ⅰ。上清液Ⅰ加入冷乙醇，调整乙醇浓度为20%，4℃静置4h，8000r/min冷冻离心10min，收集上清液Ⅱ。上清液Ⅱ继续滴加冷乙醇，调整乙醇浓度为80%，4℃静置过夜，8000r/min冷冻离心20min，收集沉淀物，得菲牛蛭活性粗提物。(2)柱层析提纯:取菲牛蛭活性粗提物与2倍量pH 6．5 PB缓冲液混合，超声提取10min，4000r/min离心10min，取上清液上柱。DEAE-Sepharose F．F．阴离子层析柱(2．5cm ×20．0cm)，以 pH 7．0 的 0．02mol/ml PB 为平衡缓冲液，0．10mol/L，0．25mol/L 和 0．8mol/L 氯化钠溶液进行等度洗脱，流速1．2ml/min，以每管8ml收集蛋白质峰，254nm紫外线在线监测，按凝血确滴定法测定各管蛋白质峰的抗凝活性。收集具有抗凝活性的蛋白峰，浓缩除盐，得菲牛蛭抗凝活性组分。(3)反相柱纯化:取菲牛蛭活性组分上柱，ODS反相柱(1．5cm ×40．0cm);洗脱体系 A:25%EtOH-0．05%TFA-0．03%NaH2PO4;B:30%EtOH-0．05%TFA-0．03%NaH2PO4;阶段洗脱，流速1m/min，6ml/管;254nm紫外在线监测，按“凝血酶滴定法”测定各管蛋白质峰的抗凝活性，结果见图2。收集具有抗凝活性的蛋白峰，冷冻干燥，得到菲牛蛭抗凝活性多肽。

5．菲牛蛭活性多肽的生化性质:(1)纯度鉴定［5］:采用三羟甲基氨基甘氨酸-十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(tricine-SDS-PAGE)分析，4%浓缩胶，15%分离胶，凝胶厚度为1mm。样品100℃加热3min使变性。(2)蛋白质含量测定:采用BCA蛋白定量分析试剂盒测定蛋白浓度。以牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)作为标准蛋白，562nm下测定其吸光度。(3)MALDI-TOF-MS/MS鉴定:将电泳凝胶条带切下，进行MALDI-TOF-MS/MS分析。

结 果

1．柱色谱提纯结果:取菲牛蛭活性粗提物过DEAE-Sepharose F．F．阴离子层析柱(2．5cm ×20．0cm)提纯，其紫外在线监测及各管抗凝活性结果见图1。

图1 DEAE-Sepharose F．F．层析图

2．反相柱纯化结果:取浓缩除盐后得到的菲牛蛭活性组分上ODS反相柱，其紫外在线监测及各管抗凝活性结果见图2。

图2 ODS反相柱色谱峰

3．纯度鉴定结果:菲牛蛭活性多肽在电泳结果显示为单一条带(图3)，这说明分离出的活性多肽是电泳纯的单链蛋白。以x代表迁移率Rf，y代表相对分子质量MW的对数，绘制标准曲线。y与x之间的直线回归方程为:y=-1．5606x+4．8616，r=0．995。菲牛蛭活性多肽的Rf值为0．37。由回归方程计算出相对分子质量约为19．2kDa。

4．蛋白质含量测定结果:蛋白标准品浓度(x)和吸光度(y)的直线回归方程:y=0．8934x+0．1007，r=0．9999。根据回归方程计算每分离纯化步骤所得的蛋白浓度、蛋白回收率及活性回收率，结果见表1。所得菲牛蛭抗凝活性多肽每克蛋白所含单位抗凝活性不低于于2548000ATU。

表1 分离纯化各步骤蛋白浓度及活性收率

5．MALDI-TOF-MS/MS鉴定结果:经质谱分析，得到菲牛蛭活性多肽电泳各条带的肽质量指纹图谱(peptide mass fingerprinting，PMF)，利用 CBNI数据库检索发现:Band 7和 Band 8为细胞色素，score 100;Band 5为嗜热蛋白，score 78;其他样品在数据库中未找到相似蛋白，提示所得菲牛蛭活性提取液中所含的抗凝物质与已发现的“水蛭素类”活性多肽结构不同，是一种新型抗凝血活性蛋白。

讨 论

目前，报道多采用生理盐水或低浓度的碱性缓冲液作为匀浆缓冲液，利用“盐溶”达到最大程度提取水蛭体内蛋白的目的。预试验过程中以匀浆上清液中溶出总活性为指标，考察生理盐水、蒸馏水和PB缓冲液的差异，结果表明三者对水蛭抗凝活性物质的溶出无统计学差异。考虑后续步骤采用离子柱层析分离，若采用盐溶液作为匀浆缓冲液，上柱前样品需经过脱盐处理，因此最终选用蒸馏水作为匀浆缓冲液。

蛋白质沉淀最常用的方法有盐析、有机试剂沉淀和酸沉淀3种。盐析沉淀蛋白质复溶性好，但含盐量高，需进一步脱盐;有机试剂沉淀与酸沉蛋白质纯化倍数高于盐析，但易引起蛋白变性;酸沉处理的样品需加入NaOH调节pH值后方可用于活性测定。实验以菲牛蛭活性物质回收率为指标，结合含盐量、活性测定、试剂毒性等因素，最终选用乙醇沉淀蛋白。

从广东菲牛蛭中分离得到的活性抗凝多肽，运用MALDI-TOF-MS/MS测定各蛋白条带的肽质量指纹图谱(peptide mass fingerprinting，PMF)，对 NCBI数据库中收载的蛭类FAST图谱进行整理后发现其中收载的蛭类蛋白序列主要包含3类物质:细胞色素、水蛭素类和重组抗凝多肽的序列或引物，而菲牛蛭相关信息较少。粗提物经电泳分离后各蛋白条带的PMF在数据库未找到相似蛋白，一方面说明了数据库信息量的不足;另一方面也提示研究的目的蛋白与已发现的“菲牛蛭素”不同，属新型抗凝蛋白。

实验以菲牛蛭冷冻鲜体为原材料，结合超滤技术、层析技术进行分离纯化，全程以凝血酶滴定法和聚丙烯凝胶电泳分析对抗凝活性物质进行追踪，获得菲牛蛭抗凝活性多肽，经验证，此工艺路线稳定可行。后续研究将对菲牛蛭抗凝活性多肽进行氨基序列分析，探讨其抗凝作用机制。

1 张卫，张瑞贤，李健，等．中药水蛭品种考证及资源可持续利用发展探讨［J］．中国中药杂志，2013，38(6):914-918

2 刘晓帆．龟甲、水蛭的品种与质量研究［D］．北京:北京中医药大学，2013:61-65

3 汪蜜，刘义梅，陈科力．水蛭抗凝血活性物质提取工艺研究概况［J］．亚太传统医药，2013，9(3):56-57

4 方富永，苗艳丽，苏舒华．双水相萃取-凝胶色谱联用法提取菲牛蛭中的水蛭素［J］．中国药学杂志，2012，47(7):489-494

5 唐芸芸．基于移动反应界面的聚丙烯酰胺凝胶电泳及其应用研究［D］．上海:上海交通大学，2013:32-35