环化小檗碱类似物A55的抗肿瘤活性及其机制研究

赵午莉 李阳彪 何红伟 宋丹青 邵荣光

小檗碱(berberine)又叫黄连素，为中药黄连中的主要生物碱。有多种药理作用，临床主要用于清热、解毒、抗肠道细菌抗感染以及糖尿病的治疗［1～3］。近年研究发现小檗碱(BBR)还具有抗肿瘤活性，体内外的抗肿瘤活性检测表明其能够特异性地抑制白血病、黑素瘤、表皮样癌、肝癌、口腔癌、恶性胶质瘤等癌细胞的增殖而不影响正常细胞的生长［4～8］。本研究所在长期进行小檗碱类衍生物的研究中，基于对相关有机反应的深刻理解，合成并构建了一类未见报道的全新化合物结构——环化小檗碱(CBBR)，即在BBR分子中又骈合了一个芳香环。结构分析后发现CBBR不但与另一类具有显著抗癌作用的生物碱——苯骈菲里啶类化合物结构相似，而且本身还具备BBR的分子结构，因此我们推测CBBR有可能为一类具有较强抗肿瘤作用的化合物，初步研究结果表明其对HCT116细胞的IC50为1．0μmol/L左右。基于此，笔者以CBBR为先导化合物较为系统地合成了30个化合物并对其抑瘤率进行了检测，结果发现CBBR的8-位经基进行芳香酰化后，引入邻氟苯甲酰基合成的化合物A55具有更强的抗肿瘤活性，因此我们着重对A55的抗肿瘤活性以及其相应机制做了进一步的研究［9］。

材料与方法

1．细胞系及化合物:人肝癌细胞系 HepG2、SMMC7721、BEL7402、BEL7404、人乳腺癌细胞 MCF-7，人肺癌细胞系A549及人大肠癌细胞系HCT116和HT29由本实验室保存;环化小檗碱及合成的相应衍生物A10～A50由笔者单位合成，结构及其合成路线见参考文献［9］。

2．主要试剂:RPMI1640培养基(GIBCO);新生胎牛血清(Hyclone公司);SRB(sulforhodamine B，Sigma公司);PI(propidium iodide，Sigma公司);预染蛋白Marker(New England Biolabs公司);DNA拓扑异构酶Ⅰ(Topgen);质粒pBR322DNA(Takara);兔抗人抗体p-ATM、r-H2AX和Cleaved Parp等抗体购自Cell Signal Technology公司。

3．化合物对肿瘤细胞的抑制率及IC50的测定:在96孔板上孔接种不同的肿瘤细胞，24h后采用不同浓度的化合物进行增殖抑制实验。细胞增殖48h后，用50%三氯乙酸 (TCA)固定，并用SRB(0．4%)稀醋酸溶液染色。室温静置10min，未与细胞结合的SRB用1% 稀醋酸溶液5遍，空气干燥。结合的SRB用10mmol/L非缓冲Tris碱液(pH值10．5)振荡溶解，酶标仪测定各孔光吸收，测定波长为492nm。根据各孔OD值计算药物对细胞增殖的抑制率。计算公式为抑制率(%)=(1-化合物OD492/对照OD492)×100%。采用Sigmaplot计算化合物的IC50。

4．流式细胞仪测定方法:用0．2μg/ml的化合物A55处理HepG2细胞，分别在0、4、8、12和24h收集药物处理后的细胞，PBS洗两次，加入预冷的75%乙醇，-20℃固定过夜，离心除去乙醇，PBS洗两次，加入200μg/ml的RNA酶，37℃消化30min，加碘化丙啶(PI)25μg/ml，4℃避光染色30min后，流式细胞仪检测细胞周期变化［10］。

5．拓扑异构酶抑制实验:将1U扑异构酶Ⅰ和不同浓度的药物在37℃反应20min，再加入0．5μg的pBR322DNA在37℃继续反应 30min，加入 0．5% 的 SDS，0．25μg/μl的溴酷兰，15%的甘油终止反应。在TBE电泳缓冲液中进行琼脂糖电泳，40V电压下，电泳4h。溴化乙淀溶液染色30min，置于紫外线下观察DNA的电泳区带，并摄片记录。

6．Western blot:将 A55加入到 HepG2细胞中，使A55的终浓度达到1μg/ml，24h后取实验组和对照组细胞，加入细胞裂解液，提取细胞总蛋白，蛋白定量后加热变性。每组取40μg蛋白经10%的SDS-PAGE电泳分离后，采用半干转电转移将蛋白转移至PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭2h，加入一抗 (1∶1000)4℃ 孵育过夜，采用TBST洗膜5次，加入HRP标记二抗(1∶5000)，室温下孵育1h，增强化学发光法(ECL)发光显色。以β-actin作为内参。

结 果

1．化合物 A55的抗肿瘤活性筛选:首先采用HCT116细胞对先导化合物CBBR及其30个衍生物(A10～A50)的抗肿瘤活性进行筛选，筛选浓度为3μg/ml。结果表明有15个化合物的抑制率达到了85%以上。接着采用0．5μg/ml的浓度对这15个化合物继续筛选。结果表明，化合物A55的抑制率最高，达到了90%左右，化合物A32和A45的抑制率分别为62%和68%，高于其他化合物。对化合物A55、A32和A45的IC50进行检测，结果表明其IC50分别为0．18 ±0．01、0．46 ±0．03 和 0．4 ±0．05μg/ml，A55 的活性最高。此后笔者选用A55(图1)对具其抗肿瘤活性进行了进一步的研究并初步探讨了其抗肿瘤机制。

2．A55对多种肿瘤细胞具有较强的抑制作用:笔者采用 BEL7402、BEL7404 SMC7721、HT29、A549 以及MCF-7等肿瘤细胞对环化小檗碱CBBR及其衍生物A55的IC50进行了检测，结果表明A55对多种类型的肿瘤均具有良好的抑制作用，抑制效果明显强于先导化合物CBBR，结果见表1和图2。

图2 A55对不同肿瘤细胞系的IC50

3．A55对拓扑异构酶Ⅰ具有较强的抑制作用:TopⅠ在体外可使DNA双链中的单链断裂，使另一单链从缺口处穿过，催化超螺旋的DNA松弛解旋。本实验中A55对拓扑异构酶Ⅰ的解螺旋活性抑制实验结果表明，A55在和pBR322DNA以及拓扑异构酶Ⅰ共同孵育时，可完全逆转拓扑异构酶Ⅰ对底物pBR322DNA的解螺旋作用，而其直接和底物pBR322DNA作用时，pBR322DNA并无明显的改变，因此我们认为A55可有效地抑制拓扑异构酶Ⅰ活性(图3)。

4．A55可将细胞周期阻滞于S期:为了进一步探化合物 A55的抗肿瘤机制，笔者检测了 A55对HepG2细胞周期分布的影响。结果表明，化合物A55作用于HepG2细胞4h后，细胞的周期开始阻滞于S期，并随着时间的增加，S期阻滞不断加强，到24h，阻滞达到最强(图4)。

图3 A55对TopⅠ的抑制作用

图4 A55对HepG2细胞周期分布的影响

5．A55通过促进 DNA链断裂引起凋亡:由于A55抑制了拓扑异构酶Ⅰ的活性，阻止了DNA断端的再连接，引起了DNA断裂和细胞凋亡。因此我们检测了A55处理细胞后细胞的凋亡以及与凋亡和DNA断裂相关蛋白的表达情况。结果表明，A55可明显引起HepG2细胞凋亡(图5A)，如细胞核浓缩、碎裂及溶解等现象。Western blot结果表明，在A55作用于HepG2细胞24h后，与DNA断裂相关的蛋白p-ATM和 γ-H2AX明显增加，凋亡相关蛋白cleaved parp和cleaved caspase-3明显增加(图5B)。

图5 A55引起细胞凋亡并激活DNA修复通路

讨 论

拓扑异构酶Ⅰ是一种核酶，可松解DNA超螺旋，在DNA的复制、转录、重组和修复等重要过程中发挥重要的作用。研究发现，肿瘤细胞中TopⅠ的含量和活性要明显高于正常细胞，如果能选择性抑制TopⅠ的生理作用，便能有效抑制肿瘤细胞的DNA的复制和转录，从而引起细胞凋亡进而抑制细胞增殖［11］。因此，TopⅠ成为抗肿瘤药物作用的重要靶点。目前在临床使用和处于研发阶段的TopⅠ抑制剂主要包括喜树碱类(camptochecines)和吲哚并咔唑类(indolocarbazoles)等化合物但由于水溶性差、不良反应强以及耐药使得这些药物的应用受到了限制，因此开发结构新且药效强的新型抗肿瘤药物非常重要［12］。Li等［13］报道小檗碱能与TopⅠ结合，使S期细胞合成受阻，阻止细胞增殖。CBBR是一类全新结构骨架的化合物——环化小檗碱，由于其具有更好的平面性结构特征，更加容易嵌入双链DNA碱基对里，推测可能具有更好的抗肿瘤作用。采用HepG2细胞对CBBR 的 IC50检测，IC50在 1．2μmol/L 左右，活性显著强于BBR［9］。A55是在CBBR结构的基础上进行改造而形成的一类衍生物，即在CBBR的8-位经基进行芳香酰化，引入邻氟苯甲酰基。改造后的 A55对HCT116的抗肿瘤活性显著强于 CBBR，IC50达到了0．18μg/ml，对其他肿瘤的结果也表明其 IC50在1μg/ml左右，显示了良好的抗肿瘤活性。

在DNA复制过程中，拓扑异构酶Ⅰ在DNA双链上产生单链断裂，使另一单链从缺口处穿过，使得DNA从超螺旋变为疏松型，进而一些与DNA复制相关的酶结合到DNA上，启动了染色体的复制。拓扑异构酶抑制剂与拓扑异构酶结合后抑制了DNA拓扑异构酶的催化活性，使得断裂的DNA不能重新进行连接，进而导致 DNA链发生致命性的破坏，造成DNA损伤，从而激活DNA损伤检验点及相应的DNA损伤应答修复通路(DNA damage response，DDR)进行修复［14，15］。这些通路包括细胞内的感应器如 ATM的快速识别损伤，启动下游多种效应成分如H2AX及引起周期阻滞的蛋白通路，提供时间进行损伤修复。其中最为显著和具有标志意义的是H2AX的磷酸化，如损伤不能正确修复或不能修复，凋亡和非凋亡性死亡(apoptosisand non-apoptoticdeath)程序将被启动［16］。环化小檗碱衍生物A55在和拓扑异构酶Ⅰ以及底物DNA共同作用时可显著抑制拓扑异构酶Ⅰ的解螺旋作用，但其单独和超螺旋DNA反应并不影响pBR322DNA的构型改变，表明A55是通过抑制拓扑异构酶的活性来影响pBR322DNA的构型。由于拓扑异构酶Ⅰ活性受到抑制，使得DNA链在解旋后不能再连接而引起DNA断裂，因此我们观察到与DNA断裂相关的蛋白如ATM和H2AX被磷酸化激活。

细胞在进行DNA复制时，需要拓扑异构酶来解螺旋并在DNA复制结束后再改变双链DNA拓扑再形成超螺旋，因此拓扑酶在细胞的S期的活性和表达量最高，因此，当拓扑酶受到抑制时，细胞的DNA复制过程会严重受阻并使得细胞可能停滞在S期。本实验中，化合物A55通过主要通过抑制拓扑异构酶的活性而引起的DNA损伤的修复，周期分布实验也证实了细胞停滞在S期，这也同样与通过抑制拓扑异构酶Ⅰ的活性而致DNA损伤的羟基喜树碱衍生物引起的S期阻滞是一样的［17］。化合物A55具体是通过激活或抑制了哪些通路而导致了S期阻滞，今后我们也将进一步进行研究。肿瘤细胞在A55的持续作用下，由于修复不能完全进而活化了促使细胞凋亡的一系列酶如csapase-3，活化后的 csapase-3裂解了parp从而最终引起细胞凋亡。

总之，环化小檗碱衍生物A55是一类镖靶明确、结构新颖以及抗肿瘤活性强的新型抗肿瘤化合物，且本所可以自主合成开发。随着对其作用机制研究的逐渐深入，这一类从生物碱中发现高效低毒的抗肿瘤新药的前景将会更加广阔。

1 蔡少平，刘泽．黄连素抑制结肠癌细胞中PGE2表达作用的研究［J］．中国医药学报，2004，19(2):95-97

2 丁阳平，叶小利，周洁，等．小檗碱衍生物合成及生理活性研究进展［J］．有机化学，2012，32(4):677-685

3 赵午莉，李阳彪，李迎红，等．13-取代小檗碱衍生物的合成及其抗肿瘤活性研究［J］．中国医药导报，2013，296(10):17-20

4 Eom KS，Hong JM，Youn MJ，et al．Berberine induces G1 arrest and apoptosis in human glioblastoma T98G cells through mitochondrial/caspases pathway［J］．Biol Pharm Bull，2008，31(4):558-562

5 Hwang JM，Kuo HC，Tseng TH，et al．Berberine induces apoptosis through a mitochondria/caspases pathway in human hepatoma cells［J］．Arch Toxicol，2006，80(2):62-73

6 Letasiova S，Jantova S，Cipak L，et al．Berberine-antiproliferative activity in vitro and induction of apoptosis/necrosis of the U937 and B16 cells［J］．Cancer Lett，2006，239(2):254-262

7 Lin CC，Lin SY，Chung JG，et al．Down-regulation of cyclin B1 and up-regulation of Wee1 by berberine promotes entry of leukemia cells into the G2/M-phase of the cell cycle［J］．Anticancer Res，2006，26(2A):1097-1104

8 Mantena SK，Sharma SD，Katiyar SK．Berberine inhibits growth，induces G1 arrest and apoptosis in human epidermoid carcinoma A431 cells by regulating Cdki-Cdk-cyclin cascade，disruption of mitochondrial membrane potential and cleavage of caspase 3 and PARP［J］．Carcinogenesis，2006，27(10):2018-2027

9 Li YB，Zhao WL，Wang YX，et al．Discovery，synthesis and biological evaluation of cycloprotoberberine derivatives as potential antitumor agents［J］．Eur J Med Chem，2013，68(10):463-472

10 Zhao W，He H，Ren K，et al．MR-1 blocks the megakaryocytic differentiation and transition of CML from chronic phase to blast crisis through MEK dephosphorylation［J］．Blood Cancer J，2013，3(3):e107

11 郭晓鹏，冯思良，王金辉，等．拓扑异构酶1及其喜树碱类抑制剂的临床研究进展［J］．国际药学研究杂志，2013，40(4):405-414

12 洪鸣凰，裴元英．羟喜树碱及其制剂的研究进展［J］．中国临床药学杂志，2008，17(4):255-258

13 Li TK，Bathory E，LaVoie EJ，et al．Human topoisomerase I poisoning by protoberberines:potential roles for both drug-DNA and drug-enzyme interactions［J］．Biochemistry，2000，39(24):7107-7116

14 马云彤．拓扑异构酶Ⅰ抑制剂介导的DNA损伤，修复和检验点应答［J］．西安文理学院学报:自然科学版，2010，13(1):44-47

15 Winter E，Levy D，Gordon JS．Changes in the H-1 histone complement during myogenesis I．Establishment by differential coupling of H-1 species synthesis to DNA replication［J］．J Cell Biol，1985，101(1):167-174

16 李俊英，张士猛，周平坤．H2AX磷酸化与去磷酸化的分子机制及其对 DNA损伤修复反应的调节作用［J］．军事医学，2013，37(3):227-230

17 Veltkamp SA，Witteveen EO，Capriati A，et al．Clinical and pharmacologic study of the novel prodrug delimotecan(MEN 4901/T-0128)in patients with solid tumors［J］．Clin Cancer Res，2008，14(11):7535-7544