细胞培养常见问题及防控措施探讨

周丽威 孙玉红 王艳

细胞培养技术是指在动植物体外生长［1］, 并不再形成组织。培养物一般为细胞群, 也可以是单个细胞, 近年来, 其已经成为很多生物制品的主要材料, 并广泛应用于医学病理研究, 本文针对细胞培养存在的一些常见问题进行分析研究,并提出相应防控措施, 现总结如下。

1 CO2的浓度水平以及培养箱的卫生条件

1.1 CO2的浓度水平 常规细胞培养的过程中, 一般CO2的浓度为5%, 对于特殊细胞群则取决于培养基中的NaHCO3浓度。

1.2 培养箱的卫生条件 CO2培养箱是一个适宜细胞群落生长的模拟环境［2］, 一般情况下, 其温度、CO2的浓度、以及酸碱度均较为恒定, 由于体外培养是细胞失去了生物体提供免疫屏障, 因此, 对其培养箱内的环境具有一定的敏感性,尤其是培养过程中的污染现象, 会为其生长带来严重影响。因此, 应定期清洁培养箱, 更换无菌水盘, 在每次清洁后, 对培养箱环境因素的相关参数进行检查, 以便及时发现污染。

2 细胞的冻存

2.1 细胞冻存液的选择 不同种类的细胞, 其冻存液的配置也不同, DMSO具有无菌特性, 因此在使用过程中无需高压灭菌, 反复冷冻, 进而有效降低了细胞污染的发生率。融合瘤细胞、淋巴细胞一般采用90%血清加10%DMSO, 肿瘤细胞选择30%小牛血清加10%DMSO, 冻存液放置时间不宜过久, 最好现用现配。

2.2 冻存浓度及方法 多数细胞冻存浓度为1×106cell/ml,有特殊细胞如淋巴细胞、融合瘤细胞等冻存浓度较高, 最佳冻存浓度为5×106cell/ml, 为防止冻存管热胀冷缩发生爆裂,因此冻存液以冻存管容量的3/4为宜。进行细胞冻存时, 应确保DMSO、血清以及培养基温度均处于室温水平, 收集对数生长期细胞, 并统计出数量, 按细胞种类配置冻存液, 掌握好浓度, 将细胞加入冻存液, 然后滴至冻存管, 密封拧紧冻存管。标注细胞种类、冻存的时间以及操作人员等。逐渐降温的条件下冻存细胞, 送至储存处。

3 细胞的复苏

3.1 细胞的解冻 在从液氮罐取出细胞时, 操作者应做好防范冻存管爆炸的相关准备［3］, 戴上防护面具和手套, 将其取出后立即投入术中, 加快其解冻速度, 在解冻的过程中,应保证管口适当高于水面, 以防细胞被水体污染。部分细胞解冻后可直接进行培养, 一些对DMSO具有较高敏感性的细胞应进行离心处理, 更换培养液继续培养。

3.2 血清与培养基 少数细胞对血清以及培养基的要求比较宽泛, 多数细胞对血清以及培养基具有特定要求, 因此,为确保细胞的活性, 在培养同一种细胞的过程中应尽量避免使用条件不同的培养基和血清。

4 细胞的污染以及相应处理措施

4.1 细胞污染类型 细胞污染是其培养过程中较为常见的现象, 操作不当、培养器皿未进行彻底消毒、培养环境差以及低无菌观念等均为导致细胞污染的重要因素。因此, 提高操作人员的技术水平、定期消毒培养箱等均为有效减少细胞污染发生的有效措施。按污染类型, 细胞污染包括真菌污染、细菌污染、病毒污染以及支原体污染。正常情况下, 很多细胞群被污染后, 会阻滞生长, 产生变形, 很难处理, 而上述菌种比所培养的细胞更具活性, 培养环境也十分有利于污染物生存, 因此, 对培养箱进行定期消毒具有重要意义。

4.2 污染细胞的相应处理措施 细胞污染后, 任何补救措施均不理想, 抗生素对细胞伤害较大, 故而, 发现细胞污染,应及时对培养的细胞行灭菌操作, 然后重新培养, 对不宜丢弃的细胞可选择广谱抗生素抑制细菌生长, 然后于48 h内更换培养液, 但是此过程会对细胞造成不同程度的损伤, 因此更换营养液时, 应当适宜增加血清浓度, 促进细胞恢复。对于微生物导致的细胞污染, 应灭菌后丢弃, 因为杀菌后更换培养液会致使大量细胞死亡, 失去继续培养的意义［4］。

综上所述, 细胞培养的操作技术要求较高, 除此之外,细胞培养成功的影响因素诸多, 例如培养的温度、酸碱度以及培养箱内的清洁情况等, 因此, 在培养细胞时, 相关操作人员应该注意细节, 遵守无菌操作原则, 尽量降低人为因素带来的不良影响, 积极研究探索细胞培养技术, 使之满足临床研究需求。

［1］ 张秀敏,郭风,王净,等.细胞培养常见问题分析及防控措施.医学信息, 2013,24(12):248-249.

［2］ 刘岚,陈绍坤,余红.贴壁细胞培养过程中支原体污染的几种救治方案疗效比较研究.现代医药卫生, 2012,24(8):1221-1222.

［3］ 吴文亮,杨新河,章蕾,等.细胞培养中污染的防控措施.临床合理用药, 2011,4(1):64-65.

［4］ 周丽薇.细胞培养技术与防止细胞污染的方法.医学信息,2012, 23(11):4587-4588.