黄曲霉毒素的检测及其降解方法进展

刘立芳

（安徽省金标准检测研究院有限公司，安徽 合肥 230088）

黄曲霉毒素（aflatoxins，AFT）是由黄曲霉（Aspergillus flavus）和寄生曲霉（Aspergillus parasiticus）代谢产生的一组化学结构类似的化合物，对人类和家畜的健康有很大的危害性。早在1960年英国发生的10万多只火鸡死亡的“火鸡X病”就是由于饲料被AFT污染引起的。AFT主要污染粮油类食品，如花生、玉米、大米等，其中以花生和玉米污染最严重[1]。在天然污染的食品和饲料中以黄曲霉毒素B1（AFB1）最为多见，其毒性也最强，被称为第一大类致癌物[2]。由于AFT危害巨大，近几十年来各国研究机构和人员对AFT的检测及降解方法开展了大量的研究，且目前仍在积极探索新的检测方法，文中主要对几类常见食品中AFT的检测及降解方法进行了综述。

1 不同种类食品中黄曲霉毒素的检测方法

AFT的检测方法从最初以薄层层析法为主，发展到高效液相色谱法、微柱法、酶联免疫吸附法等多种方法，其进展与新的化学检测手段和新仪器的出现密不可分。

1.1 粮油及其制品中黄曲霉毒素的检测方法

AFT对人类健康的危害主要是由于人们食用了被AFT污染的食物[3]。据联合国粮农组织（food and agriculture organization，FAO）估计，全世界每年因AFT污染而不能直接食用的粮食占总产量的25%。

高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）测定AFT是目前国际上普遍采用的定量筛选和确认的分析方法。用HPLC测定AFT一般分提取、净化（富集）、衍生和测定几个步骤。提取方法主要根据样品的物理化学性质来确定。AFT易溶于带极性的溶剂，常用的有机溶剂有甲醇、乙腈等[4-5]，对脂肪含量较高的样品，可加入非极性溶剂正己烷进行脱脂[6]。少量的水可以湿润基质，增强有机溶剂在样品中的渗透能力，提高提取效率，因此常采用有机溶剂与水的混合溶液作为提取液。STROKA J等[7]分别对3中提取液（对甲醇-水、乙腈-水和丙酮-水）的适用性进行了研究，结果表明甲醇-水的适用性广，被推荐作为常用的提取剂。对AFT的净化一般采用固相萃取的方法，主要分为两类，免疫亲和柱（immunoaffinity column，IAC）和多功能净化柱（multifunctional purification column，MFC）。其中IAC较为常见。BRERA C等[8]用IAC净化黄曲霉毒素，采用两步洗脱法洗脱。李佩暖等[9]将使用过的免疫亲和柱分别用甲醇-水、水冲洗，再用磷酸缓冲液（phosphate buffer solution，PBS）缓冲液进行填充，放入冰箱于2～8℃保存，回收率和精密度均达到检测要求，且柱体可重复使用2次。衍生方法常用的有柱前衍生法和柱后衍生法[10]。HPLC测定AFT选用的激发波长为365nm，发射波长为450nm，以保留时间定性，峰面积定量，这些基本参数大致相同。

HPLC常与其他检测器联用以期获得更快速准确的检测结果，如高效液相色谱-质谱联用法（high performance liquid chromatography-mass spectrometry，HPLC-MS）就是一种良好的检测AFT方法[11]。特别是随着大气压电离技术，尤其是电喷雾离子源技术发展逐步成熟，使HPLC-MS成为检测AFT的强有力工具之一[12-13]。HPLC-MS法也是我国目前出口粮油及其制品中检测AFT的首要方法[14]。

高志杰[15]采用HPLC以正己烷和三氯乙酸为衍生剂，同时测定花生及玉米种的4种AFT含量；王秀嫔等[16]建立了超声提取-液相色谱-电喷雾三重串联四级杆质谱测定玉米、大豆等粮油固体样品中的4种AFT，有效降低了基质效应的影响，极大提高了方法的准确度；齐齐[17]采用酶联免疫法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）法用甲醇-水对样品进行简单的提取后在对提取液进行一定倍数的稀释，即可获得比较满意的结果，省去了用三氯甲烷进行重复提取的步骤，不仅提高了回收率，也简化了样品的提取过程，提高了工作效率，减少了挥发性溶剂对实验室和实验人员可能产生的污染。

1.2 饲料中黄曲霉毒素的检测方法

饲料中测定AFT的首选方法也是HPLC-MS法[18]。朱聪英等[6]建立了液相色谱一串联质谱法测定饲料中6种AFT（包括AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、AFM1、AFM2）的方法。有效缩短了检测时间，扩展了检测毒素种类，节约了检测成本。

薄层层析法（thin-layer chromatography，TLC）是测定饲料中AFT的经典方法，其原理是将样品经过提取、柱层析、洗脱、浓缩、薄层分离后，在波长365nm紫外光下产生蓝紫色或黄绿色荧光，根据荧光大小和强弱与标准品比较进行定性和定量。杨焱等[19]把粉碎过筛的样品加水湿润后，加入氯仿，振荡、过滤，并将滤液在温度65℃水浴上挥发干，再用苯-乙腈溶液转移，通过点板，用乙醚预展后，再用氯仿-丙酮（92∶8）展开，在波长365nm的紫外光下观察，根据AFB1、AFB2、AFG1和AFG2分别显示的蓝紫色、蓝紫色、绿色和蓝色荧光，在扫描仪上绘制AFT扫描图谱，并由此分辨出AFT种类；最后作定量分析，即以斑点面积的积分值为纵坐标，标准品质量浓度为横坐标，绘制标准曲线，建立回归方程，得到样品的AFT素含量。

1.3 乳及乳制品中黄曲霉毒素的检测方法

动物摄取AFT后会通过乳汁排出，乳（特别是牛乳）及其制品是人类尤其是婴幼儿的主要食品，我国规定婴幼儿配方食品中AFT不得超过0.5μg/kg[20]。检测方法主要有液相色谱—串联质谱联用法、高效液相色谱法、荧光分光光度法、酶联免疫法等[21]。

酶联免疫吸附法（ELISA）是利用抗原和抗体两者之间的特异性结合反应检测各种物质的方法，并且通过测定酶活力来增加灵敏度，能广泛用于食品中对AFT的测定[22-23]。

酶联免疫试剂盒提供的方法一般只针对鲜乳样品，对于成分复杂的配方乳粉容易干扰酶联免疫反应，导致假阳性的出现。梁迪思等[24]通过方法改进，用甲醇-水（1∶1）提取再经三氯甲烷净化，能有效消除假阳性现象。周相娟等[25]建立了乳粉中AFM1的高效液相色谱-串联四极杆质谱联的快速测定方法。张国梁等[26]利用高效液相色谱，建立了针对干酪中AFM1的快速高效的检测方法。

2 黄曲霉毒素的降解方法

AFT的治理以预防为主，污染严重的粮食和饲料应当废弃，对于轻度污染的则必须进行脱毒处理。脱毒方法一般有物理脱毒法、化学脱毒法和生物降解脱毒法。

2.1 物理脱毒法

物理脱毒法方法简单，常用的有挑选法、高温处理法、加工法、吸附法、辐射法等。张国辉等[27]在饲料中加入水合铝硅酸钠钙、沸石、膨润土、活性炭等可以吸附大部分AFT。物理脱毒法常常不能使AFT失去活性，而且对原来的营养成分破坏比较大。

2.2 化学脱毒法

AFT在碱性条件下不稳定，内酯环被破坏，反应生成邻位香豆素钠盐，这种钠盐能溶于水，故加碱后再用水洗可将毒素除去。但该法设备投资大，成本高，已逐渐被淘汰[28]。

氨能同AFB1发生脱羟基作用，因此可以用氨处理法脱除AFT[29]。陈志娟等[30]研究采用氨气熏蒸法降解玉米中AFB1的最优条件：玉米含水量为20%，氨熏温度37℃，氨熏时间为96h，氨气体积分数为7.05%，在此条件下玉米中AFB1降解率为92%。

臭氧熏蒸法是基于物理和化学氧化双重作用的脱毒方法。陈冉等[31]研制了一种花生AFT污染臭氧脱毒专用装置，以下部通入臭氧气体，上部排气的方式，臭氧浓度6.0mg/L、处理时间30min、花生水分含量为5%时，花生中AFT总量和AFB1的脱毒率分别为65.88%和65.90%，脱毒效果显著。

2.3 生物学脱毒法

生物学脱毒是近年来国内外研究AFT脱毒解毒的热点[32]，主要是微生物菌体本身及其细胞壁提取物吸附AFT，或微生物代谢产生的酶，或从植物中提取的酶降解AFT。生物学脱毒法同其他方法相比具有安全性高，处理条件温和，专一性强，不影响食品的营养价值等优点，目前报道的能够降解黄曲霉毒素的细菌不多，有橙色黄杆菌（Flavobacterium aurantiacum）、分支杆菌（Mycobacterium fluoranthenivorans）、红串红球菌（Rhodococcus erythropolis）、橙红色粘球菌（Myxococcus fulvus）等[33]。

王宁等[34]对1株具有降解AFB1活性的黏细菌的产酶条件进行了优化。优化后的培养基为：酵母粉7g/L、CaCl2·2H2O为1g/L、MgSO4·7H2O为0.5g/L、VB12为750μg/L；并确定其最佳培养条件为：初始pH7.5、接种量20%、发酵时间50h、发酵温度30℃。在上述最佳培养基和最佳发酵条件下，该菌株降解AFB1的能力为78.2%。刘睿杰等[35]对筛选出的巨大芽孢杆菌进行固态发酵，在料水比1∶1.1，发酵温度35.9℃，发酵时间64.3h条件下，花生粕中AFB1的去除率达68.54%。吉小凤等[36]筛选出具有脱除AFB1的发酵乳杆菌株LAB-10，该菌株属于益生菌，生物安全性高，对质量浓度为14μg/L的AFB1在48h的降解率为63.4%，其脱毒机理为生物降解作用。于会民等[37]通过添加AFT酶制剂能有效消除AFT对仔猪的危害。尹逊慧等[38]添加AFT解毒酶制剂减轻或基本消除了AFT对肉鸡生长性能和组织器官的不良影响。

3 存在的问题及展望

AFT检测方法近年来有了很大的发展，许多新方法、新手段的应用，为AFT的检测提供了更广泛的选择余地，适应了不同的检测目的和要求。但由于国际和国内AFT限制正在逐步加强，限量标准也在不断降低，所以需要找到一种灵敏度高，特异性强，简便快速，容易普及应用的方法来检测AFT。对AFT的脱毒方法现在虽然有很多种，但从安全经济的角度考虑，防毒应比脱毒更重要。生物降解处理条件温和，安全性高，但生物降解的反应条件苛刻，成本较高，实际应用价值有所限制，因此探寻高效、廉价的微生物及其制剂，是生物学脱毒得到广泛应用的关键。

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