与自身免疫T1D 相关的控制iNKT 细胞发育的基因

李 莉 李惠英 钟海燕 樊 茂 刘晓宁 (云南省昆明市儿童医院，昆明 650000)

iNKT 细胞(invariant Natural killer T cells，iNKT cells)，半恒定自然杀伤T 细胞，是一群能够调控机体抗病毒、细菌、真菌、寄生虫、肿瘤、同种异体移植物以及自身组织免疫反应的免疫调节性T 细胞［1，2］。与传统T 细胞相比，iNKT 细胞不仅具有CD1d 限制性，而且可以同时表达NK 细胞表面标志CD161(人类)(鼠类NK1.1)以及恒定的Vα24-Jα18/Vβ11 T 细胞受体(TCR)(人类)(鼠类Vα14-Jα18/Vβ8.2、7、2 TCR)。iNKT 细胞可通过其表面TCR 与抗原递呈细胞表面的MHC Ⅰ样分子——CD1d 递呈的糖脂质抗原结合而激活，活化后快速产生大量的细胞因子，调节天然免疫和适应性免疫应答［3］。1 型糖尿病(Type 1 diabetes，T1D)是器官特异性的自身免疫反应性疾病［4］。近年来大多数研究表明，iNKT 细胞数量减少、功能缺失与自身免疫T1D 的发生密切相关［5，6］。虽然目前对于iNKT细胞减少引发自身免疫T1D 的作用机制尚不清楚，但新近发现的一些参与调控iNKT 细胞发育以及参与iNKT 细胞调控T1D 的相关基因、信号分子将可能成为评价人类自身免疫T1D 发生风险的关键指标［7，8］。因此，本文将对这些相关基因、信号分子在控制NKT 细胞发育以及与T1D 发病之间的联系展开综述。

1 控制NKT 细胞表达的相关基因座位——Nkt1、Nkt2、Idd

非肥胖型糖尿病小鼠(NOD 小鼠)是多种自身免疫性疾病(Autoimmunity disease，AID)的易感动物，包括T1D、系统性红斑狼疮(Systemic lupus erythematosus，SLE)、实验性自身免疫性脑脊髓炎(Experimental autoimmune encephalomyelitis)等。目前已证明，NOD 小鼠胸腺、肝脏、脾脏中的NKT 细胞数量远远低于其他常见种系小鼠，而且其NKT 细胞产生IL-4 的量也相对较低，相比C57BL/6 小鼠低将近20 倍［9-11］。

有研究通过比对NOD 小鼠与C57BL/6 小鼠的基因图谱，筛选出了与NKT 细胞数量具有重要联系的两个基因座位:即C57BL/6 小鼠1 号染色体上的Nkt1 座位和2 号染色体上的Nkt2 座位，这两个基因座位分别与NOD 狼疮小鼠1 号染色体远端的易感基因Babs2/Bana3 以及NOD 糖尿病小鼠2 号染色体上的易感基因Idd13 相对应［12-14］。这说明NOD小鼠AID 的发生与这两个基因座位的缺陷具有很大的关系，而正因为缺乏这些基因座位的表达，才使得其体内的NKT 细胞数量极少、功能缺失、并导致机体内T1D、SLE 等AID 的发生。

有研究发现，C57BL/6 小鼠杀伤细胞的凝集素样受体亚家族B(Klrb)Ⅱ型跨膜蛋白C 型凝集素受体中的两个受体(Klrb1c/NKR-P1C、Klrb1b/NKRP1B)均可与NK1.1 抗体-PK136 反应，而NOD 小鼠体内的淋巴细胞却并不能与之反应，这说明C57BL/6 小鼠淋巴细胞内含有可以表达NK1.1(即具有Klrb1c/ NKR-P1C 及Klrb1b/ NKR-P1B)的自然杀伤细胞(Natural killer cells，NK cells)以及NKT 细胞，而在NOD 小鼠淋巴细胞中却缺少这些细胞。因此，为了使NOD 小鼠体内也可产生具有表达NK1.1特性的杀伤细胞，研究者通过回交杂种的方式，首先将亲本代C57BL/6 小鼠与NOD 小鼠进行杂交，产生了子代共基因NOD Nkrp1b 系小鼠(既可表达NK1.1，又携带有C57BL/6 等位基因Klrb1c);而后又将其与父母代C57BL/6 小鼠回交，回交至少10代后产生的子代NOD 小鼠，因具有父母代C57BL/6小鼠更多的遗传背景(C57BL/6 小鼠可表达Nkt1b、Nkt2b)，才 被 称 为 NOD.Nkrp1b Nkt1 小 鼠 或NOD.Nkrp1b Nkt2 小鼠［12-15］。

Jordan 等［12］研究发现，与NOD.Nkrp1b 小鼠相比，NOD.Nkrp1b Nkt1 小鼠胸腺和脾脏内NKT 细胞数量表达增加。这说明通过与C57BL/6 小鼠杂交、回交，NOD 小鼠体内获得了更多的C57BL/6 Nkt1座位，该基因的表达修复了NOD 小鼠体内NKT 细胞缺失的功能。然而，值得一提的是，NOD.Nkrp1b Nkt1 小鼠体内的NKT 细胞数量虽然增高了，但却并不能防止T1D 的发生，这可能与小鼠体内增加的NKT 细胞未成熟有关。

Fletcher 等［16］发现，与NOD.Nkrp1b 小鼠相比，NOD.Nkrp1b Nkt2 小鼠可以产生更多的胸腺NKT细胞亚群，并能减少T1D 的发生几率。通过采用微阵列技术对NOD.Nkrp1b Nkt2 小鼠和NOD.Nkrp1b小鼠的胸腺细胞进行基因表达分析，Fletcher 等鉴别出了控制NKT 细胞数量的潜在基因——过氧化物酶膜蛋白编码基因Pxmp4，而过氧化物酶在糖脂代谢过程中是很重要的。而且Pxmp4 还绑定于伴侣/膜运输分子Pex19，而Pex19 又是在Nkt1 连锁区域被编码的。这些相关的证据表明Nkt1、Nkt2 在NKT细胞的表达过程中可能具有非常重要的调控作用。

此外，胰岛素依赖性糖尿病(Insulin-dependent diabetes，Idd)基因，作为与T1D 发生密切相关的易感基因，在控制NKT 数量表达的过程中，其也可能参与其中［17］。Jordan 等［12］研究发现，C57BL/6 小鼠2 号染色体上的Nkt2 基因座位与NOD 糖尿病小鼠2 号染色体上的易感基因Idd13 相对应。目前发现至少有两个基因位点与Idd13 有关，其中一个是β2m(编码β2-微球蛋白)，而NKT 细胞TCR 识别的CD1d 又是β2m 依赖的膜整合糖蛋白［16，17］，这说明这些基因位点的表达与否很可能与NKT 细胞的活化程度有关。另外，Ueno 等［18］还报道称，在Idd9.1基因座位表达的T1D 易感基因产物可能在致病机制中起着关键的作用。

综上所述，Nkt1、Nkt2 及Idd 基因的表达与NKT细胞数量的控制密切相关，并且这种控制将对NKT细胞减少或功能缺失诱导的AID 的发生发展产生影响。

2 调控NKT 细胞发育的相关信号分子——SLAM、SAP、Slamf1、Slamf6

近期研究发现，淋巴细胞信号活化分子(Signaling lymphocytic activation molecule，SLAM)、SLAM 相关蛋白(SLAM associated protein，SAP)以及SLAM-SAP 信号通路的活化在NKT 细胞的发育过程中是必不可少的关键因素［19，20］。SAP 表达于T细胞、NK 细胞表面、并绑定于SLAM 家族受体的细胞质部分、通过招募Fyn、介导细胞内信号通路的活化，而调控胸腺NKT 细胞的发育。动物模型研究表明，SAP 介导信号通路的活化程度与自身免疫性疾病的发生密切相关，因此其被认为是导致人体病理发生的重要因素［21］。

Jordan 等［12］通过微阵列技术分别 对NOD.Nkrp1b Nkt1 小鼠以及NOD.Nkrp1b 小鼠进行了基因表达分析，结果发现:Slamf1 和Slamf6(分别编码SLAM 和ly108)很可能是调控Nkt1 表达、并控制NKT 细胞数量产生多少的最主要基因。因为Slamf1 编码的受体分子SLAM 可与SAP 结合、活化SAP 信号，而SLAM-SAP 信号又是NKT 细胞发育过程中必不可少的信号通路，有研究证实在SAP 缺失或其下游Src 激酶Fyn 缺失的小鼠体内NKT 细胞严重缺陷［22-24］。

流式细胞检测结果也证实:与NOD.Nkrp1b 小鼠相比，NOD.Nkrp1b Nkt1 小鼠胸腺细胞表面的、Slamf1 编码的免疫球蛋白样受体SLAM 的表达水平呈显著上升。这归根结底还在于野生型NOD 小鼠的胸腺细胞发育时，其表面的SLAM 表达存在异常。因此，即便子代NOD.Nkrp1b 小鼠已开始遗传C57BL/6 小鼠杀伤细胞的特性，但未经过多次回交，其胸腺NKT 细胞表面的SLAM 表达还是相对较低的［25］。除此之外，Jordan 等［12］还研究证实:C57BL/6 和NOD.Nkrp1b Nkt1 小鼠体内的双阳性胸腺细胞表面的SLAM 表达水平已达到了峰值，而在成熟的单阳性细胞中其表达水平相对降低;与之相反的是，在NOD.Nkrp1b 小鼠体内，单阳性胸腺细胞亚群表面表达的SLAM 最高，而在双阳性细胞内SLAM表达却相对较低。这说明SLAM 在胸腺中的表达高低直接关系到NKT 细胞的发育速度，即SLAM 表达增高，将促进双阳性NKT 细胞(未成熟)在胸腺中的发育，反之，双阳性NKT 细胞发育将受到阻滞。对于上述研究发现的SLAM 在C57BL/6 小鼠胸腺细胞的表达模式，同样得到另一研究结论的支持，该研究显示Slamf1 和Slamf6 基因在双阳性胸腺细胞内的表达接近了峰值，而在单阳性细胞内两者表达水平下降。由此可见，等位基因的变异对于双阳性胸腺细胞表面SLAM 的表达水平是影响很大的，而这也直接关系到NKT 细胞的发育过程。双阳性胸腺细胞表面SLAM的表达下降，使得在NKT 细胞发育过程中，SLAMSLAM 同型连接功能降低，接着SAP 信号减弱，最终导致NKT 细胞发育阻滞，这也可能就是NOD 小鼠体内NKT 细胞缺陷的原因［25］。

SLAM 表达缺陷除可导致上述NKT 细胞发育阻滞外，还可导致NOD 小鼠NKT 细胞功能失活。例如，有研究发现当髓样树突状细胞和NKT 细胞系之间的SLAM-SLAM 连接被蛋白肽键阻断后，Th2 型细胞因子(IL-4/IL-10)会应激产生选择性修复［25］。

Slamf6 是与Slamf1 紧密连接的、可能影响NKT1 效 应 的 潜 在 基 因［12，22］。有 学 者 将 骨 髓 和Slamf1/Slamf6 双突变体的嵌合体混合，研究Slamf1和Slamf6 的表达对NKT 细胞发育的影响，结果证明Slamf6 也参与了NKT 细胞的发育。该研究首先将Ja18-/-小鼠经放射线照射后，接着将CD45 标记的野生型小鼠骨髓和Slamf1 及Slamf6 缺失的嵌合体小鼠骨髓分别与经放射线照射后的Ja18-/-小鼠骨髓以1 ∶1比例混合，然后将混合后的骨髓再分别导入经放射线照射的Ja18-/-小鼠体内、重建免疫功能，结果发现Slamf1 和Slamf6 缺失的细胞不能刺激产生与野生型相同数目的NKT 细胞，而且表达嵌合体的小鼠也因Slamf1 和Slamf6 的缺失导致在阳性选择后NKT细胞的正常增殖分化功能受到破坏［25］。

由此可见，SLAM、SAP、Slamf1、Slamf6 在调控NKT 细胞表达方面发挥着非常重要的作用。通过收集并借鉴研究这些基因、分子的表达信息，将为后期深入研究NKT 细胞减少诱导AID 发生的相关分子机制提供有力的证据，有望在未来将NKT 细胞应用于临床治疗指明新方向。

［1］Colonna M，Jonjic S，Watzl C.Natural killer cells:fighting viruses and much more［J］.Nat Immunol，2011，12 (2):107-110.

［2］Simoni Y，Diana J，Ghazarian L，et al.Therapeutic manipulation of natural killer (NK)T cells in autoimmunity:are we close to reality?［J］.Clin Exp Immunol，2013，171(1):8-19.

［3］Rossjohn J，Pellicci DG，Patel O，et al.Recognition of CD1d-restricted antigens by natural killer T cells［J］.Nat Rev Immunol，2012，12(12):845-857.

［4］Gan MJ，Albanese-O'Neill A，Haller MJ.Type 1 diabetes:current concepts in epidemiology，pathophysiology，clinical care，and research［J］.Curr Probl Pediatr Adolesc Health Care，2012，42(10):269-291.

［5］Ghazarian L，Simoni Y，Pingris K，et al.Regulatory role of NKT cells in the prevention of type 1 diabetes［J］.Med Sci (Paris)，2013，29(8-9):722-728.

［6］Novak J，Lehuen A.Mechanism of regulation of autoimmunity by iNKT cells［J］.Cytokine，2011，53 (3):263-270.

［7］Esteban LM，Tsoutsman T，Jordan MA，et al.Genetic control of NKT cell numbers maps to major diabetes and lupus loci［J］.J Immunol，2003，171 (6):2873-2878.

［8］Pociot F，Akolkar B，Concannon P，et al.Genetics of type 1 diabetes:what's next?［J］.Diabetes，2010，59 (7):1561-1571.

［9］Thayer TC，Wilson SB，Mathews CE.Use of nonobese diabetic mice to understand human type 1 diabetes［J］.Endocrinol Metab Clin North Am，2010，39 (3):541-561.

［10］Driver JP，Serreze DV，Chen YG.Mouse models for the study of autoimmune type 1 diabetes:a NOD to similarities and differences to humanDisease［J］.Semin Immunopathol，2011，33(1):67-87.

［11］Cho YN，Kee SJ，Lee SJ，et al.Numerical and functional deficiencies of natural killer T cells in systemic lupus erythematosus:their deficiency related to disease activity ［J］.Rheumatology(Oxford)，2011，50 (6):1054-1063.

［12］Jordan MA，Fletcher JM，Pellicci D，et al.Slamf1，the NKT cell control gene Nkt1［J］.J Immunol，2007，178(3):1618-1627.

［13］Rocha-Campos AC，Melki R，Zhu R，et al.Genetic and functional analysis of the Nkt1 locus using congenic NOD mice:improved V{alpha}14-NKT cell performance but failure to protect against type 1 diabetes［J］.Diabetes，2006，55(4):1163-1170.

［14］Chen YG，Driver JP，Silveira PA，et al.Subcongenic analysis of genetic basis for impaired development of invariant NKT cells in NOD mice［J］.Immunogenetics，2007，59 (9):705-712.

［15］Stolp J，Chen YG，Cox SL，et al.Subcongenic analyses reveal complex Interactions between distal chromosome 4 genes controlling diabetogenicB cells and CD4 T cells in nonobese diabetic mice［J］.J Immunol，2012，189(3):1406-1417.

［16］Fletcher J，Jordan M，Snelgrove S，et al.Congenic analysis of the NKT cell control gene Nkt2 implicates the peroxisomal protein Pxmp4［J］.J Immunol，2008，181 (5):3400-3412.

［17］Bluestone JA，Herold K，Eisenbarth G.Genetics，pathogenesis and clinical interventions in type 1 diabetes［J］.Nature，2010，464(7293):1293-1300.

［18］Ueno A，Wang J，Cheng L，et al.Enhanced early expansion and maturation of semi-invariant NK T cells inhibited autoimmune pathogenesis in congenic nonobese diabetic mice ［J］.J Immunol，2008，181(10):6789-6796.

［19］Jordan MA，Fletcher JM，Jose R，et al.Role of SLAM in NKT cell development revealed by transgenic complementation in NOD mice［J］.J Immunol，2011，186(7):3953-3965.

［20］Verykokakis M，Boos MD，Bendelac A，et al.SAP protein-dependent natural killer T-like cells regulate the development of CD8(+)T cells with innatelymphocyte characteristics［J］.Immunity，2010，33(2):203-215.

［21］Furukawa H，Tohma S，Kitazawa H，et al.Role of SLAMassociated protein in the pathogenesis of autoimmune diseases and immunological disorders［J］.Arch Immunol Ther Exp (Warsz)，2010，58(1):37-44.

［22］Griewank K，Borowski C，Rietdijk S，et al.Homotypic interactions mediated bySlamf1 and Slamf6 receptors control NKT cell lineage development［J］.Immunity，2007，27 (5):751-762.

［23］Veillette A，Dong Z，Pérez-Quintero LA，et al.Importance and mechanism of 'switch' function of SAP family adapters［J］.Immunol Rev，2009，232(1):229-239.

［24］Schwartzberg PL，Mueller KL，Qi H，et al.SLAM receptors and SAP influencelymphocyte interactions，development and function［J］.Nat Rev Immunol，2009，9(1):39-46.

［25］Baev D，Caielli S，Ronchi F，et al.Impaired SLAM-SLAM homotypic interaction between invariant NKT cells and dendritic cells affects differentiation of IL-4/IL-10-secreting NKT2 cells in nonobese diabetic mice［J］.J Immunol，2008，181(2):869-877.